酶消化法

摘要： 背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用.目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索.目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体.方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1％ Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10％胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO2培养箱内进行原代培养.待细胞达80％-90％融合时,以1:3的比例进行传代培养.倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验.结果 与结论:①原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80％-90％,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;②流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;③第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10 d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;④由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法.

摘要： 目的探索一种操作简单且高效的成纤维细胞提取方法,并对免过滤酶消化法提取成纤维细胞的效果进行评价。方法将瘢痕疙瘩标本分别采用免过滤酶消化法、传统酶消化法、组织块贴壁法进行细胞提取。记录细胞长满瓶底80%所需时间,并检测3组细胞的增殖活性及胶原分泌情况。结果免过滤酶消化法提取细胞,在接种后2~3 d可观察到瓶底的组织碎屑周边有芽状细胞游出,向四周呈放射状生长;单独贴壁的细胞生长良好。该组细胞长满瓶底80%所需时间较传统酶消化法节约(3.25±0.89)d,较组织块贴壁法节约(9.50±1.64)d,差异有统计学意义(P0.05)。结论免过滤酶消化法步骤少,操作简单,且不会增加污染概率或对细胞增殖活性及胶原分泌功能产生明显影响,是一种高效提取成纤维细胞的方法,值得推广。

摘要： 目的:探讨人肾上腺组织单细胞悬液制备的最佳消化方法。方法:收集来自广西医科大学第二附属医院手术终止妊娠的16~18孕周胎儿肾上腺组织3例,分别使用3种消化方案(A方案:HBSS溶液中加入1 mg/mLⅠ型胶原酶,0.1 mg/mL DNaseⅠ;B方案:HBSS溶液中加入1 mg/mLⅡ型胶原酶,0.1 mg/mL DNaseⅠ;C方案:HBSS溶液中加入1 mg/mLⅣ型胶原酶,0.1 mg/mL DNaseⅠ)进行消化。采用显微镜计数得到单细胞总数和细胞存活率;通过mRNA测序获得不同消化方案的差异基因表达并对其功能进行分析;使用实时荧光定量PCR检测不同消化方案得到的细胞的标志基因相对表达量;使用流式细胞术检测CYP17A1^(+)类固醇细胞和CHGA+嗜铬细胞的比例。结果:使用A方案和B方案消化得到的单细胞悬液结团少、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净,而使用C方案得到的单细胞悬液有少量结团;使用B方案和C方案消化得到的细胞存活率差异均无统计学意义(均P>0.05);类固醇细胞标志基因CYP11A1,CYP17A1,CYP11B1,类固醇调控基因SF-1,MC2R和成熟的嗜铬细胞标志基因CHGA的表达水平均在使用B方案消化时较高。结论:使用B方案消化是较优选的单细胞悬液制备方法。

摘要： 猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型。猪出生后,骨骼肌的生长发育、损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提。随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来。背最长肌、后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好。常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞。常使用的培养基为DMEM/F12+10%胎牛血清(FBS)+1%青-链霉素(P/S)。骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(PAX3)、PAX7、生肌决定因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)等。作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离、培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持。

摘要： 背景:常用的获得软骨细胞的方法有机械-酶消化法、链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法以及单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法。目的:探讨SD大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原酶体外分离、提取、鉴定方法,观察原代至第3代软骨细胞的形态学特点。方法:课题组采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)体外分离、提取、培养SD大鼠膝关节软骨细胞并进行传代培养,进而构建其体外培养体系。使用细胞增殖实验、倒置相差显微镜观察细胞组织学形态;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等方法进行细胞性状鉴定。实验经大连大学附属中山医院伦理委员会批准。结果与结论:①镜下观察与细胞增殖实验均显示第2,3代细胞形态、增殖能力最佳,后逐渐退化;②甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等组织学检测显示,第3代体外培养软骨细胞状态功能良好;③结果表明,一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)能够成功地从SD大鼠膝关节标本中分离出软骨细胞并且可以进行传代培养;体外培养3代后软骨细胞去分化特性逐渐增强,第3代体外培养软骨细胞性状良好,可用于实验研究。

摘要： 背景:常用的获得软骨细胞的方法有机械-酶消化法、链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法以及单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法.目的:探讨SD大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原酶体外分离、提取、鉴定方法,观察原代至第3代软骨细胞的形态学特点.方法:课题组采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)体外分离、提取、培养SD大鼠膝关节软骨细胞并进行传代培养,进而构建其体外培养体系.使用细胞增殖实验、倒置相差显微镜观察细胞组织学形态;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等方法进行细胞性状鉴定.实验经大连大学附属中山医院伦理委员会批准.结果 与结论:①镜下观察与细胞增殖实验均显示第2,3代细胞形态、增殖能力最佳,后逐渐退化;②甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等组织学检测显示,第3代体外培养软骨细胞状态功能良好;③结果表明,一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)能够成功地从SD大鼠膝关节标本中分离出软骨细胞并且可以进行传代培养;体外培养3代后软骨细胞去分化特性逐渐增强,第3代体外培养软骨细胞性状良好,可用于实验研究.

摘要： 目的 比较组织块法与酶消化法对分离培养人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的影响.方法 选取5根足月妊娠自然分娩的健康婴儿的废弃脐带,采用组织块法和酶消化法进行原代分离培养,比较两种培养方法的细胞增殖情况,并测定其细胞表面免疫标志物.结果 hUC-MSCs的融合状况:组织块法培养的第5天,细胞从组织块内爬出,培养2周左右细胞融合率可达80％ 以上;酶消化法培养5 d后,可见少量形态不规则的细胞贴壁,培养2周后细胞融合可达40％ ～50％.hUC-MSCs的增殖情况:组织块法原代及传代后的hUC-MSCs的增殖速度远高于酶消化法,差异有统计学意义(P95％;酶消化法分离培养的P3细胞表面CD34、CD45、HLA-DR、CD105表达95％.结论 组织块法与酶消化法相比,能获得较纯的hUC-MSCs,且方法简单、成本低,是获得hUC-MSCs的理想方法.

摘要： 目的:了解脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)的获取及原代培养方法,明确体外定向分化条件,为进一步ADSCs移植实验提供基础.方法:取6周龄雄性大鼠,脱颈处死,在无菌条件下取大鼠腹股沟处脂肪组织,放入装有PBS的培养皿中,剔除肉眼可见的血管及筋膜,分别用酶消化法及悬浮组织块法培养、传代及鉴定,并比对两种方案的优缺势.结果:悬浮法和酶消化法培养得到的大鼠ADSCs形态均为梭形纤维样,生长迅速,生长曲线为典型的"S"形,两种方法获得的ADSCs经成骨诱导培养3周后茜素红染色均为阳性,成脂诱导培养3周后,油红染色也均为阳性.结论:大鼠提取的脂肪组织经两种培养方法均可定向诱导分化为ADSCs,并可稳定增殖传代,但悬浮法较酶消化法更便利,价格更低廉.

摘要： 目的探讨人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC)的体外分离及培养方法。方法人升主动脉组织取自在北部战区总医院接受外科主动脉置换手术的A型主动脉夹层患者。无菌条件下撕除主动脉内膜,获得中膜,将中膜剪成约2 mm长的组织块,用0.15%的Ⅱ型胶原酶消化组织块10 h,吹打后接种于6孔板中,显微镜下观察培养不同时间点的细胞形态特征,免疫荧光染色法检测平滑肌细胞标志物SMα-actin及SM 22α的表达。结果胶原酶消化法可成功将平滑肌细胞从主动脉中膜分离出来。分离出的细胞在培养第1天开始贴壁,第7天呈现典型长梭形,第14天基本融合。培养的细胞SMα-actin及SM 22α染色阳性。结论本研究采用酶消化法成功从主动脉夹层患者标本中分离并培养出HAoSMC,为进一步阐明主动脉疾病的发病机制奠定了基础。

摘要： 研究目的：探讨胶原酶消化法分离并培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的方法。rn 方法：将1-7日龄雏鸡的肺动脉中膜剪成小于1mm2的组织块，0.1％Ⅱ型胶原酶消化分离PASMC并进行原代培养和传代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的形态，对培养细胞进行HE染色和光学显微镜观察，并采用抗α肌动蛋白单克隆抗体(α-Smooth muscle actin)免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白的表达，用以鉴定所培养的细胞。rn 结果：倒置显微镜下细胞为长梭形，呈典型的“峰-谷”状，未见明显异型细胞。α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的97％以上。 结论：胶原酶消化法可用于分离培养肉鸡PASMC，且有方法简单，成活细胞数多、传代周期短的特点，可用于肉鸡心血管疾病如肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。

摘要： 目的：通过Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶在不同浓度下消化能力的比较，探讨适合于髓核细胞分离培养的消化酶和浓度.rn 方法：椎间盘髓核组织剪碎，分成2大组：分别用胰蛋白酶+胶原酶Ⅰ型(A组)、胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ型(B组)消化，各大组根据不同浓度分别为0.2％，0.1％和0.02％，在消化2，4，8，24，48，72h时在倒置显微镜下计算髓核细胞数，台盼蓝染色检查其活力.rn 结果：各组在相同时间点、相同浓度下比较，Ⅱ组细胞数多于Ⅰ组，48h后3组细胞数无明显差异，0.02％Ⅱ型胶原酶消化组细胞活力较其他两组高.rn 结论：极低浓度Ⅱ型胶原酶消化法不仅可以节省酶量，而且对髓核细胞的损伤小，适于髓核细胞消化培养.

摘要： 本文建立满足多种研究需要的,分化良好的人类鼻粘膜上皮细胞体外模型。酶消化法获得的鼻粘膜上皮细胞纯度高，细胞数量大，活性好。

摘要： 目的:建立满足多种研究需要的，分化良好的人类鼻黏膜上皮细胞体外模型。方法:取27例鼻息肉或正常鼻黏膜，采取O.1％ProteaseXIV和0.001％DNase消化标本，并对其中8例计数。分别从培养基及培养模式(气-液界面、浸泡方式)两个方面对比并优化培养方案，建立了气液界面下，ALI培养基培养方案。结论：酶消化法获得的鼻黏膜上皮细胞纯度高，细胞数量大，活性好。血清及胶原均有促进细胞贴壁的作用，且二者有协同作用，可在培养早期加入血清协助细胞贴壁;血清对上皮细胞生长具有抑制作用，且使培养的上皮细胞呈复层鳞状化改变，不适合长期培养。良好的鼻黏膜上皮细胞分化至少需保证高浓度的Ca、RA及低浓度的EGF。分化良好的鼻黏膜上皮腔面无基底细胞，基底细胞可能在损伤修复过程中发挥重要作用。

摘要： 雪旺细胞(SC)在周围神经再生中的作用已被广泛证实。SC培养是对SC进行生物学研究的基 础。新生大鼠神经组织虽取材量有限，但含结缔组织量较成年动物少得多，易于分离，便于培养，因此对SC进行生物学研究多取材于新生大鼠。但为避免免疫排斥而在动物或人进行同体SC移植时，则涉及到成年动物或人的SC培养问题，因此探索成年动物SC在体外增殖纯化的方法具有一定实际意 义。SC培养目前主要采用酶消化法和植块法，由于成年动物神经组织含结缔组织多，细胞相对量少，酶消化法虽然获得SC速度快，但混入成纤维细胞而纯度不高，而且消化时间不容易掌握，过长则容 易损伤细胞。植块法虽然获得SC纯度高但由于细胞迁移速度慢，培养所需时间长。本文探索将两种 方法优点结合，通过短时间酶消化松散植块后再进行植块培养，以期能够快速获得高纯度的雪旺细胞。

摘要： 目的：建立一种人类风湿性关节炎滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法。方法：关节镜下钳取膝关节滑膜组织,采用组织块培养法和酶消化法分离滑膜细胞。经台盼蓝拒染计数,将细胞按3.2×10接种于培养瓶,传代培养。从形态学、光镜、细胞免疫化学、生长特性鉴定细胞类型。结果：反复贴壁和多次消化达到形态学上的纯化要求,纯度达96％以上,活性率为98％,成纤维细胞经鼠抗人单克隆抗体染色阳性,符合B型滑膜细胞特征。结论：本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、培养和纯化方法。为类风湿性关节炎致病机理的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型。

摘要： 作者采用酶消化法,从牛软骨中提取Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行了纯化和鉴定,用以探讨治疗类风湿性关节炎的发病机制和病理特征.

摘要： 本发明公开了一种利用生物酶法水解的乳清蛋白及其在消化吸收障碍营养食品中的应用。涉及食品制备技术领域。本发明提供了乳清蛋白的制备方法：将乳清蛋白粉和水混合，加热，保温，冷却待用；酶解；超滤浓缩即得生物酶法水解的乳清蛋白。本发明对于各种术后肠胃功能粘膜损伤造成的消化吸收障碍具有良好的辅助改善作用，对于患者的康复起到了积极的干预作用，且营养较为丰富。

摘要： 本发明公开了一种评测猪饲料消化能的仿生酶法，该方法包括以下步骤：（1）将饲料粉碎后与缓冲液混合，再加入仿生的动物胃液消化酶液,混合均匀后调整pH值为酸性进行胃仿生消化，得到胃仿生消化液；（2）向胃仿生消化液中加入缓冲液、调整pH值后加入仿生的动物小肠消化酶液进行小肠仿生消化，得到小肠仿生消化液；（3）将小肠仿生消化液调整pH值、加入仿生的动物大肠消化酶液进行大肠仿生消化得到大肠仿生消化液；（4）将大肠仿生消化液过滤，测定残渣重，计算消化能。本发明评测猪饲料消化能的仿生酶法具有精度高、稳定性强和重复性好等优点，能够在生产实际中进行推广应用。

摘要： 本发明涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的酶消化法原代培养及鉴定方法，包括以下步骤：获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到平滑肌组织细胞悬液；将所述平滑肌组织细胞悬液置于预铺左旋多聚赖氨酸的培养容器中，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或局部细胞生长拥挤。本发明对食管胃结合部平滑肌细胞的酶消化法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。

摘要： 本发明涉及一种通过体外酶消化法评定豆粕家禽有效氨基酸含量的方法；首先分析测定豆粕样品中氨基酸含量(AAi)，利用两步酶法(胃蛋白酶—胰酶)体外消化豆粕，通过豆粕样品中氨基酸含量×体外干物质消失率(AAi×DMD)与其对应的家禽有效氨基酸含量(EAAi)的实测值进行回归分析，建立待测豆粕样品中各种氨基酸含量、体外干物质消失率与有效氨基酸含量的数学模型，用于快速评定豆粕家禽有效氨基酸含量。本发明可以快速评定豆粕家禽有效氨基酸含量且适于生产应用，为更精确地配制家禽饲料提供保障。

摘要： 本发明涉及一种非酶消化法获取树鼩大脑星形胶质细胞的分离培养方法，属于细胞分离培养技术领域。本发明以gentleMACS全自动组织处理器解离脑组织，消化传代时用TrypLE Express替代常用的胰酶来消化树鼩大脑星形胶质细胞，并含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基进行培养。通过本发明方法可以轻松的实现树鼩大脑星形胶质细胞的体外分离培养，进一步简化了分离方法，缩短周期，减轻细胞伤害，分离效率大大提高，星形胶质细胞特异性标志物‑胶质纤维状酸性蛋白免疫荧光染色率高，能够满足医学、生物学等研究领域对星形胶质细胞相关实验研究的要求。

摘要： 本发明公开了一种改良酶消化法分离骨细胞的技术及其应用，涉及骨细胞培养技术领域，具体而言，该分离培养方法通过酶解消化骨胶原和分步脱钙，能稳定分离并获得高纯度的骨细胞和成骨细胞，且分离的效率高，操作简单易实施，为骨细胞和/或成骨细胞的功能研究提供了一种新的途径。

摘要： 本发明涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的酶消化法原代培养及鉴定方法，包括以下步骤：获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到平滑肌组织细胞悬液；将所述平滑肌组织细胞悬液置于预铺左旋多聚赖氨酸的培养容器中，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或局部细胞生长拥挤。本发明对食管胃结合部平滑肌细胞的酶消化法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。

摘要： 本发明涉及一种通过体外酶消化法评定豆粕家禽有效氨基酸含量的方法；首先分析测定豆粕样品中氨基酸含量(AAi)，利用两步酶法(胃蛋白酶—胰酶)体外消化豆粕，通过豆粕样品中氨基酸含量×体外干物质消失率(AAi×DMD)与其对应的家禽有效氨基酸含量(EAAi)的实测值进行回归分析，建立待测豆粕样品中各种氨基酸含量、体外干物质消失率与有效氨基酸含量的数学模型，用于快速评定豆粕家禽有效氨基酸含量。本发明可以快速评定豆粕家禽有效氨基酸含量且适于生产应用，为更精确地配制家禽饲料提供保障。

摘要： 本发明公开了一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，采用Langendorff灌注装置经主动脉逆行灌流，依次用含钙液、无钙EGTA液、Ⅱ型胶原酶液灌流，收集Ⅱ型胶原酶循环液加入10%BSA溶液，将心室置于其中恒温摇床震荡消化，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，过滤，滤液自然沉降，收集细胞沉淀，悬浮在酶洗脱液中重复沉降即得心肌细胞，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心脏的活细胞产量最高可达约（5-8）×10

摘要： 本发明提供一种酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的方法，其包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入4ng/mlEGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。本发明的酶消化法联合联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化hAMSCs的方法。