DNA免疫

摘要： 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性.Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因.为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能,采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体.通过PCR扩增Lbe基因序列,将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同源重组,以该同源重组载体免疫4周龄小鼠,获得含有抗Lbe多克隆抗体的血清.蛋白质印迹(Western blot)和胚胎抗体染色结果表明,该抗体的特异性较好.该抗体为随后的Lbe功能的研究奠定了基础.

摘要： 目的:通过优化DNA质粒制备高同源性小鼠抗大鼠CD138抗体。方法:优化DNA质粒转录后调节元件和分子佐剂增强DNA免疫反应。通过将HPRE、WPRE、HTLV-1R转录后调节元件和鞭毛蛋白(FliC)佐剂分别克隆入pCAGGS,获得pCAGGSHPRE、pCAGGS-WPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC载体;将luciferase和大鼠CD138基因分别克隆入相应载体,进行体外表达检测;选用3个质粒(pCD138、pHCD138、pFCD138)分别免疫BALB/C小鼠,比较免疫反应强度和抗大鼠CD138抗体数量和质量。结果:与对照组(pCD138)相比,含FliC质粒显著地降低大鼠CD138表达(P0.05)。含FliC质粒明显提高小鼠免疫反应,其他质粒相对较弱;而且含FliC质粒组动物免疫反应较快,明显缩短免疫周期,获得高质量阳性杂交瘤单克隆抗体。结论:嵌合FliC和大鼠CD138明显提高抗原特异性免疫反应,最终获得两株高亲和力杂交瘤单克隆抗体(35-G11、39-D2)。

摘要： 目的:通过优化DNA质粒制备高同源性小鼠抗大鼠CD138抗体.方法:优化DNA质粒转录后调节元件和分子佐剂增强DNA免疫反应.通过将HPRE、WPRE、HTLV-1R转录后调节元件和鞭毛蛋白(FliC)佐剂分别克隆入pCAGGS,获得pCAGGS-HPRE、pCAGGS-WPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC载体;将luciferase和大鼠CD138基因分别克隆入相应载体,进行体外表达检测;选用3个质粒(pCD138、pHCD138、pFCD138)分别免疫BALB/C小鼠,比较免疫反应强度和抗大鼠CD138抗体数量和质量.结果:与对照组(pCD138)相比,含FliC质粒显著地降低大鼠CD138表达(P0.05).含FliC质粒明显提高小鼠免疫反应,其他质粒相对较弱;而且含FliC质粒组动物免疫反应较快,明显缩短免疫周期,获得高质量阳性杂交瘤单克隆抗体.结论:嵌合FliC和大鼠CD138明显提高抗原特异性免疫反应,最终获得两株高亲和力杂交瘤单克隆抗体(35-G11、39-D2).

摘要： DNA免疫是将编码特异性抗原的重组表达载体转入动物体内,特异性基因序列在动物体内得以表达并诱导产生其特异性抗体的一系列免疫应答过程.目前,DNA免疫已成为多种保护性以及诊断性单克隆抗体研究和开发的主要技术手段,尤其对于在体外难以表达和纯化的抗原,DNA免疫比传统的蛋白免疫占绝对优势.DNA免疫在宿主细胞内表达抗原及递呈方式类似于病毒感染,既能产生体液免疫,又能产生细胞免疫,由此克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷,为制备高质量单克隆抗体提供了良好的技术平台.然而这项技术在实践应用中遇到了不少挑战,尤其是以传统的肌肉注射法免疫单一的质粒DNA,使递送效率和抗体表达水平都很低,导致DNA免疫的低免疫原性.综述了DNA免疫技术在单克隆抗体开发中的应用,对DNA免疫相关概念、诱导机制、载体的构建、递送方式、不同免疫佐剂的影响、优点和发展前景等方面进行论述,旨在为DNA免疫技术在制备高质量单克隆抗体中的应用以及提高其免疫效率提供有效的理论知识.

摘要： 近年来研究发现,DNA疫苗能有效诱导机体产生高质量的抗体反应.深入探讨了DNA免疫技术诱导宿主免疫反应尤其是抗原特异性抗体反应的分子机制,并介绍如何将这一技术应用到单克隆抗体的诱导开发,包括DNA疫苗构建、递送方式、分子佐剂和DNA初免-蛋白质加强免疫等有关具体技术要点.

摘要： Objective: To evaluate the optimum immune dose for a DNA vaccine of the major outer membrane multiepitope (M0MP168) from Chlamydia trachomatis (Ct) in mice, in order to directly offer valuable experimental information for the following research about immunological effects. Methods: Based on the successful construction and purification of recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168,BALB/c mice were administered respectively with three different immune dose of 50, 100 and 150 μg of pcDNA3.1(+)/Ct M0MP168 by intra-muscular injection, and control group was administered with PBS buffer. All mice were repeatedly immunized three times at two weeks intervals. Serum was collected in week 0, 2, 4, 6, 8 for measurement of specific antibodies IgG against recombinant Ct MOMP168 protein with ELISA, while, the vaginal washings were collected in week 0, 1, 3, 5, 7 to measure SIgA against recombinant Ct M0MP168 protein also with ELISA,and then the data were handled by statistical analysis. Results: The production of specific IgG in serum from immunized mice with three different immunization doses began to gradually increase with the prolonged immunity,and the level of IgG in group mice immunized with maximum dose of 150 μg was higher than that in other groups (P<0.05). While, the production of specific secret IgA in vaginal washings generated fast, in week 1 after immunization, the level of SIgA in group mice immunized with maximum dose of 150 μg was higher than that in other groups (P<0.05), SIgA began to decline in week 7, but the level of SIgA in mice immunized 150 μg dose was still higher than that in other groups (PDNA免疫小鼠的特异性抗体生成显示了剂量依赖关系,高剂量(150μg)免疫组小鼠血清特异性抗体IgG和阴道分泌性特异性抗体SIgA生成水平优势显著.

摘要： 为了制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2ORF3基因,对其PCR产物用EcoRI与XhoI进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coliDH5a感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,抗体检测结果表明成功制备了具有较高效价的PCV2ORF3抗体。研究结果提示:可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2ORF3抗体,为PCV2ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。

摘要： AIM:To identify methylation profile and novel tumor marker of extrahepatic cholangiocarcinoma(CCA)with high throughout microarray.METHODS:Differential methylation profile was compared between normal bile duct epithelial cell lines and CCA cell lines by methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP)microarray.Bisulfite-polymerase chain reaction (BSP)was performed to identify the methylated allels of target genes.Expression of target genes was investigated before and after the treatment with DNA demethylating agent.Expression of candidate genes was also evaluated by immunofluorescence in 30 specimens of CCA tissues and 9 normal bile duct tissues.RESULTS:Methylation profile of CCA was identified with MeDIP microarray in the respects of different gene functions and signaling pathways.Interestingly,97 genes with hypermethylated CpG islands in the promoter region were homeobox genes.The top 5 hypermethylated homeobox genes validated by BSP were HOXA2(94.29%),HOXA5(95.38%),HOXA11 (91.67%),HOXB4(90.56%)and HOXD13(94.38%).Expression of these genes was reactivated with 5’-aza2’-deoxycytidine.Significant expression differences were found between normal bile duct and extrahepatic CCA tissues(66.67%-100%vs 3.33%-10%).CONCLUSION:HOXA2,HOXA5,HOXA11,HOXB4 and HOXD13 may work as differential epigenetic biomarkers between malignant and benign biliary tissues.

摘要： 本研究通过HBV核心基因DNA重组质粒联合干扰素（IFN）γ基因表达质粒同时免疫动物，了解经联合细胞因子DNA免疫后，免疫小鼠T细胞增殖、自然杀伤（NK）细胞杀伤活性及细胞因子释放等免疫效应。探讨联合IFNγ基因表达质粒用于DNA免疫的应用价值。

摘要： 为了提高表达含有PRRSV GP5基因DNA疫苗的免疫效应,本研究通过人工合成的方法将GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子,并将其作为免疫原基因,连同野生型GP5基因,分别插入带有CMV启动子的表达载体pIRES1neo中,构建重组质粒plR-optiGP5和pIR-GP5。将这两种质粒分别转染293T_细胞,转染后48h,采用间接免疫荧光和Western blot方法检测GP5基因的体外表达情况,结果两种检测方法显示重组质粒pIR-optiGP5的蛋白表达量明显多于pIR-GP5。为了评价DNA免疫质粒pIR-optiGP5的免疫效果,选取30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为三组,每组10只,将pIRES1neo、pIR-GP5、pIR-optiGP5分别以100,μg/只剂量,进行肌肉多点注射,共免疫三次,每次间隔2周,同时利用间接免疫荧光技术、流式细胞技术、淋巴细胞特异性增殖试验等方法检测其体液免疫和细胞免疫水平。结果显示:DNA免疫质粒pIR-optiGP5在二免后即可检测到荧光抗体,而pIR-GP5在三免后才能检测到;同时发现用pIR-optiGP5质粒免疫小鼠的CD4、CD8T淋巴细胞百分数及特异性刺激指数均高于pIR-GP5免疫小鼠。我们推测经过密码子优化的GP5基因其蛋白在小鼠体内得到了较高水平的表达,并诱导了较强的免疫应答,这为进一步研究和设计有效的PRRSV DNA疫苗提供了新的思路。

摘要： 为了提高表达含有PRRSV GP5基因DNA疫苗的免疫效应,本研究通过人工合成的方法将GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子,并将其作为免疫原基因,连同野生型GP5基因,分别插入带有CMV启动子的表达载体pIRES1neo中,构建重组质粒plR-optiGP5和pIR-GP5。将这两种质粒分别转染293T_细胞,转染后48h,采用间接免疫荧光和Western blot方法检测GP5基因的体外表达情况,结果两种检测方法显示重组质粒pIR-optiGP5的蛋白表达量明显多于pIR-GP5。为了评价DNA免疫质粒pIR-optiGP5的免疫效果,选取30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为三组,每组10只,将pIRES1neo、pIR-GP5、pIR-optiGP5分别以100,μg/只剂量,进行肌肉多点注射,共免疫三次,每次间隔2周,同时利用间接免疫荧光技术、流式细胞技术、淋巴细胞特异性增殖试验等方法检测其体液免疫和细胞免疫水平。结果显示:DNA免疫质粒pIR-optiGP5在二免后即可检测到荧光抗体,而pIR-GP5在三免后才能检测到;同时发现用pIR-optiGP5质粒免疫小鼠的CD4、CD8T淋巴细胞百分数及特异性刺激指数均高于pIR-GP5免疫小鼠。我们推测经过密码子优化的GP5基因其蛋白在小鼠体内得到了较高水平的表达,并诱导了较强的免疫应答,这为进一步研究和设计有效的PRRSV DNA疫苗提供了新的思路。

摘要： 为了提高表达含有PRRSV GP5基因DNA疫苗的免疫效应,本研究通过人工合成的方法将GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子,并将其作为免疫原基因,连同野生型GP5基因,分别插入带有CMV启动子的表达载体pIRES1neo中,构建重组质粒plR-optiGP5和pIR-GP5。将这两种质粒分别转染293T_细胞,转染后48h,采用间接免疫荧光和Western blot方法检测GP5基因的体外表达情况,结果两种检测方法显示重组质粒pIR-optiGP5的蛋白表达量明显多于pIR-GP5。为了评价DNA免疫质粒pIR-optiGP5的免疫效果,选取30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为三组,每组10只,将pIRES1neo、pIR-GP5、pIR-optiGP5分别以100,μg/只剂量,进行肌肉多点注射,共免疫三次,每次间隔2周,同时利用间接免疫荧光技术、流式细胞技术、淋巴细胞特异性增殖试验等方法检测其体液免疫和细胞免疫水平。结果显示:DNA免疫质粒pIR-optiGP5在二免后即可检测到荧光抗体,而pIR-GP5在三免后才能检测到;同时发现用pIR-optiGP5质粒免疫小鼠的CD4、CD8T淋巴细胞百分数及特异性刺激指数均高于pIR-GP5免疫小鼠。我们推测经过密码子优化的GP5基因其蛋白在小鼠体内得到了较高水平的表达,并诱导了较强的免疫应答,这为进一步研究和设计有效的PRRSV DNA疫苗提供了新的思路。

摘要： 为了提高表达含有PRRSV GP5基因DNA疫苗的免疫效应,本研究通过人工合成的方法将GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子,并将其作为免疫原基因,连同野生型GP5基因,分别插入带有CMV启动子的表达载体pIRES1neo中,构建重组质粒plR-optiGP5和pIR-GP5。将这两种质粒分别转染293T_细胞,转染后48h,采用间接免疫荧光和Western blot方法检测GP5基因的体外表达情况,结果两种检测方法显示重组质粒pIR-optiGP5的蛋白表达量明显多于pIR-GP5。为了评价DNA免疫质粒pIR-optiGP5的免疫效果,选取30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为三组,每组10只,将pIRES1neo、pIR-GP5、pIR-optiGP5分别以100,μg/只剂量,进行肌肉多点注射,共免疫三次,每次间隔2周,同时利用间接免疫荧光技术、流式细胞技术、淋巴细胞特异性增殖试验等方法检测其体液免疫和细胞免疫水平。结果显示:DNA免疫质粒pIR-optiGP5在二免后即可检测到荧光抗体,而pIR-GP5在三免后才能检测到;同时发现用pIR-optiGP5质粒免疫小鼠的CD4、CD8T淋巴细胞百分数及特异性刺激指数均高于pIR-GP5免疫小鼠。我们推测经过密码子优化的GP5基因其蛋白在小鼠体内得到了较高水平的表达,并诱导了较强的免疫应答,这为进一步研究和设计有效的PRRSV DNA疫苗提供了新的思路。

摘要： 构建了表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白的重组DNA质粒pcDNA3.1(+)-orf2,并在哺乳动物表达系统COS7细胞中进行了瞬时表达,RT-PCR和间接免疫荧光均证明了所构建的重组质粒能够正确表达PCV2衣壳蛋白.用重组质粒pcDNA3.1(+)-orf经肌肉注射途径免疫Balb/c小鼠,结果表明,首免疫后7d,免疫小鼠血清中即可检测到特异性抗体,阳性率为40％(4/10),三免后14d阳性率为80％.重组质粒免疫鼠脾细胞对ConA或重组PCV2衣壳蛋白的刺激反应增强,CTL特异性杀伤活性和NK细胞非特异性杀伤活性均明显高于空载体和PBS对照组.结果说明构建的表达PCV2衣壳蛋白的重组质粒能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫反应。

摘要： 本发明涉及一种分离鉴定DNA结合蛋白的方法，具体涉及利用DNA免疫共沉淀技术分离鉴定DNA结合蛋白的方法。所述分离方法包括：提取细胞的核蛋白；将目标DNA分子与核蛋白混合；加入能够与该目标DNA分子结合的分子实体，分离得到与目标DNA分子结合的核蛋白组分；对得到的核蛋白组分进行进一步分离，得到DNA结合蛋白。所述鉴定方法还包括对分离得到的DNA结合蛋白进行鉴定的步骤。本发明的方法具有稳定性和重复性好的特点，显著提高了鉴定未知DNA结合蛋白的实验效率。为深入研究细胞基因转录调控、基因转录的分子行为、分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科提供了有益的帮助。

摘要： 本发明公开一种使用大剂量DNA免疫技术免疫动物使血清中抗体滴度提高的方法，包括：步骤1)将蛋白质抗原表达质粒、CPG‑ODN佐剂和Aluminum Phosphate佐剂混合，制成混合液；步骤2)用该混合液对动物进行多个部位的注射免疫，每间隔7‑14天重复注射一次，经过多次注射后检测动物血清中针对特异性抗原的抗体滴度；免疫动物为大鼠、小鼠。蛋白质抗原表达质粒的用量为每只大鼠或小鼠100～500ug，CPG‑ODN佐剂的用量为每只大鼠或小鼠5‑15ug，Aluminum Phosphate佐剂用量为免疫材料总体积的1/2体积。本发明的方法能够明显增加受者动物免疫反应，提高血清中抗体滴度，获得比常规DNA免疫更高的血清效价。本发明还提供DNA免疫与蛋白免疫交叉轮流免疫方法能提高血清效价，并增加单克隆抗体的多样性。

摘要： 本发明涉及了一种基于金属离子依赖性DNA酶用于检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：采用水热合成法、种子介导生长法和物理吸附法制备了功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料；以化学键合法合成了信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球/DNA‑1信号标签；以功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料/金属离子依赖性DNA酶/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银为参比电极，得到了用于邻苯二甲酸二丁酯检测的电化学传感器；与传统电化学传感器相比，具有响应速度快、灵敏度高、选择性好、准确度高的优点。

摘要： 本发明公开了DNA免疫吸附剂在制备抗ds‑DNA抗体检测试剂中的应用。本发明DNA免疫吸附剂在制备抗ds‑DNA抗体检测试剂中的应用，是基于本发明发明人发现将DNA免疫吸附剂用于免疫荧光，可定性分析肾组织中沉积的抗ds‑DNA抗体，同时可特异性确认抗ds‑DNA抗体在肾组织中的沉积和分布，且方法简单易操作，适于制备检测和分析狼疮肾和红斑狼疮的试剂。

摘要： 本发明涉及一种分离鉴定DNA结合蛋白的方法，具体涉及利用DNA免疫共沉淀技术分离鉴定DNA结合蛋白的方法。所述分离方法包括：提取细胞的核蛋白；将目标DNA分子与核蛋白混合；加入能够与该目标DNA分子结合的分子实体，分离得到与目标DNA分子结合的核蛋白组分；对得到的核蛋白组分进行进一步分离，得到DNA结合蛋白。所述鉴定方法还包括对分离得到的DNA结合蛋白进行鉴定的步骤。本发明的方法具有稳定性和重复性好的特点，显著提高了鉴定未知DNA结合蛋白的实验效率。为深入研究细胞基因转录调控、基因转录的分子行为、分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科提供了有益的帮助。

摘要： 本发明涉及针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗，其旨在用于寻求预防的人或者已发展出了癌症的已经被HPV感染的那些人。本发明还涉及DNA表达载体，其能够有效地产生HPV16病毒的衣壳蛋白L2，以及还有与人乳头瘤病毒肿瘤相关的病毒癌蛋白E6。特别地，本发明涉及通过基因克隆到表达载体中来获得重组的融合或杂合蛋白，其通过经由将一个或多个基因的核酸调控序列与一个或多个基因的蛋白质编码序列相组合而形成的融合基因的基因翻译来产生，其用于生成两种不同类型的应答：持久的体液免疫应答，其能够刺激针对HPV的特异性抗‑L2和抗‑E6抗体的产生(预防作用)，以及激活细胞免疫应答，以对抗肿瘤细胞并且诱导细胞因子TNF(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。

摘要： 本发明公开一种使用大剂量DNA免疫技术免疫动物使血清中抗体滴度提高的方法，包括：步骤1)将蛋白质抗原表达质粒、CPG‑ODN佐剂和Aluminum Phosphate佐剂混合，制成混合液；步骤2)用该混合液对动物进行多个部位的注射免疫，每间隔7‑14天重复注射一次，经过多次注射后检测动物血清中针对特异性抗原的抗体滴度；免疫动物为大鼠、小鼠。蛋白质抗原表达质粒的用量为每只大鼠或小鼠100～500ug，CPG‑ODN佐剂的用量为每只大鼠或小鼠5‑15ug，Aluminum Phosphate佐剂用量为免疫材料总体积的1/2体积。本发明的方法能够明显增加受者动物免疫反应，提高血清中抗体滴度，获得比常规DNA免疫更高的血清效价。本发明还提供DNA免疫与蛋白免疫交叉轮流免疫方法能提高血清效价，并增加单克隆抗体的多样性。

摘要： 本发明属于电化学检测技术领域，公开了一种基于DNA‑多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用。本发明公开了一种基于DNA‑多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器，该传感器首次使用DNA‑多肽偶联物作为抗污染材料，通过两类重要生物分子功能的集成优化，协同增强抗污染效果。本发明制备的传感器可有效抵挡复杂体液环境中蛋白质等生物分子的非特异性吸附，实现在复杂真实样本中对免疫球蛋白G的灵敏检测。经实验验证，DNA‑多肽偶联物确比单一的DNA或多肽具有更优异的抗污染效果和更好的实际应用潜力。

摘要： 本发明公开了一种融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫鼎分子DNA疫苗及其构建方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明提供的免疫鼎分子DNA疫苗ZD‑nCor19以新型冠状病毒RBD蛋白、S2亚基的301‑538aa区段和N蛋白的138‑369aa区段作为靶抗原，并在适当位置引入特定的免疫增效类分子，可以同时高效诱导体液免疫和细胞免疫，并且可以避免由全长S蛋白和全长N蛋白可能产生的ADE相关的安全性问题，兼具有预防和治疗的双重效果，可以作为一种抗新型冠状病毒感染的一类安全高效稳定性疫苗品种。

摘要： 一种融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗及其构建方法和应用，其中提供的免疫DNA疫苗ZD‑nCor19以新型冠状病毒RBD蛋白、S2亚基的301‑538aa区段和N蛋白的138‑369aa区段作为靶抗原，并在适当位置引入特定的免疫增效类分子，可以同时高效诱导体液免疫和细胞免疫，并且可以避免由全长S蛋白和全长N蛋白可能产生的ADE相关的安全性问题，兼具有预防和治疗的双重效果。