利用DNA免疫共沉淀分离和鉴定DNA结合蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种分离鉴定DNA结合蛋白的方法，具体涉及利用DNA免疫共沉淀技术分离鉴定DNA结合蛋白的方法。所述分离方法包括：提取细胞的核蛋白；将目标DNA分子与核蛋白混合；加入能够与该目标DNA分子结合的分子实体，分离得到与目标DNA分子结合的核蛋白组分；对得到的核蛋白组分进行进一步分离，得到DNA结合蛋白。所述鉴定方法还包括对分离得到的DNA结合蛋白进行鉴定的步骤。本发明的方法具有稳定性和重复性好的特点，显著提高了鉴定未知DNA结合蛋白的实验效率。为深入研究细胞基因转录调控、基因转录的分子行为、分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科提供了有益的帮助。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离鉴定DNA结合蛋白的方法，具体涉及利用 DNA免疫共沉淀技术分离鉴定DNA结合蛋白的方法。

背景技术

生物医学研究已从一个基因一个蛋白的假说演绎到在组学水平分 析众多基因或蛋白的功能。由于细胞的各种生命活动现象纷繁复杂，全 基因组的序列信息并不能诠释细胞的生物功能，而基因的终极产物蛋白 才是细胞构成及功能的最终执行者。在细胞生命的过程中，特异基因的 开启和关闭是一个复杂的系统工程，人类基因的转录调控一直以来都是 生物学家研究的热点领域。目前，主要利用染色质免疫沉淀技术（ChIP） 研究已知蛋白转录因子与DNA相互作用，在基因转录调控中，转录因 子及转录调节因子与染色质DNA即启动子区之间存在相互作用，染色 质免疫共沉淀技术不仅解决了已知转录因子与启动子DNA直接和间接 的相互作用，而且还可以利用实时定量PCR测定转录因子与DNA结合 的丰度，筛选出转录因子所结合的特异的启动子序列。

当前，科学家利用大规模的蛋白质组学技术发展并绘制了广泛的细 胞内蛋白质之间相互作用的网络图谱。迄今已发展了多种研究蛋白质相 互作用的技术方法，包括酵母双杂交系统、噬菌体展示技术、GST pμll-down技术、免疫共沉淀技术和串联亲和纯化联合质谱分析技术， 为蛋白质相互作用及蛋白质组学的研究奠定了坚实的基础。但目前尚缺 少利用已知DNA序列分离特异结合细胞核蛋白并进一步鉴定DNA结合 蛋白的方法。

发明内容

本发明的发明人经过大量实验和反复摸索，提供了一种利用DNA 免疫共沉淀技术分离和/或鉴定DNA结合蛋白的方法以及所述方法的 用途，具体包括以下几个方面：

本发明第一方面涉及一种分离DNA结合蛋白的方法，所述方法 包括以下步骤：

1）提取细胞的核蛋白；

2）将目标DNA分子与核蛋白混合，孵育；

3）加入能够与该目标DNA分子结合的分子实体，分离得到与目 标DNA分子结合的核蛋白组分；

4）对步骤3）得到的核蛋白组分进行进一步分离，得到DNA结 合蛋白；

优选地，所述目标DNA分子连接有可检测的标记。

在本发明中，所述细胞为真核细胞；所述真核细胞例如可以为哺 乳动物细胞；其中所述哺乳动物例如为人、小鼠、大鼠、狗、猪、羊、 猴等。

在本发明中，所述提取细胞核蛋白的方法为本领域所公知。在本 发明的实施方案中，所述提取核蛋白的方法包括，采用匀浆器裂解细 胞，分离细胞核组分,将核组分经过蔗糖密度梯度离心，纯化细胞核组 分，并进一步用含有蛋白抑制剂的高盐裂解液制备细胞核蛋白，然后 降低盐离子浓度，去除核组分的DNA成分。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中在步骤1）后还包括去 除核蛋白中无关高丰度蛋白的步骤。

在本发明中，所述无关高丰度蛋白主要包括组蛋白。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述去除核蛋白中无关 高丰度蛋白的步骤包括：将非特异DNA分子与核蛋白混合，孵育， 加入能够与该非特异DNA分子结合的分子实体，去除能够与该非特 异DNA分子结合的核蛋白；

优选地，所述非特异DNA分子能够与无关高丰度蛋白结合。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述DNA结合蛋白是 指转录因子或者转录活化因子。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述能够与该DNA分 子结合的分子实体为能够与该标记特异性DNA结合的分子实体；和 所述分子实体还偶联有易分离的物质，例如磁珠。

在本发明中，所述可检测的标记为本领域所公知。在本发明的实 施方案中，其中所述可检测的标记为生物素，其中所述能够与该标记 的DNA分子结合的分子实体为亲和素，例如链霉亲和素。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中步骤4）中所述分离得 到与目标DNA分子结合的核蛋白组分，包括对结合的核蛋白组分进 行洗脱的步骤。

在本发明中，可以根据不同的标记分子选择洗脱液。

在本发明的实施方案中，所述洗脱液可以将结合在DNA分子上 的蛋白复合体洗下，而分子实体与易分离的物质保持结合。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中步骤4）中所述分离的 方法为分离蛋白的方法，例如为电泳，例如为蛋白质电泳，例如为聚 丙烯酰胺凝胶电泳。

在本发明的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳可以为 SDS-PAGE，脉冲场凝胶电泳（PFGE），双向电泳等。

在本发明的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为十二烷基硫 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

本发明第二方面涉及一种鉴定DNA结合蛋白的方法，所述方法 包括本发明第一方面任一项的方法，以及对分离得到的DNA结合蛋 白进行鉴定的步骤；

任选地，在鉴定后还包括对鉴定得到的蛋白进行比对和分析的步 骤。

在本发明的实施方案中，其中所述鉴定的方法为质谱鉴定方法， 例如为高质量精度质谱、MALDI-TOF、LTQ等。

本发明第三方面涉及本发明第一或第二方面任一项的方法用于分 离和/或鉴定DNA结合蛋白的用途。

根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述DNA结合蛋白为转 录因子或转录活化因子。

本发明第四方面涉及一种去除核蛋白中无关高丰度蛋白的方法， 所述方法包括将非特异DNA分子与核蛋白混合以及孵育的步骤；

优选地，所述方法还包括加入能够与该非特异DNA分子结合的分 子实体的步骤；

优选地，所述非特异DNA分子连接有可检测的标记；

优选地，所述非特异DNA分子能够与无关高丰度蛋白结合。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述能够与该DNA分子 结合的分子实体为能够与该标记特异性结合的分子实体；和/或，所述 分子实体还偶联有易分离的物质，例如磁珠。

在本发明中，所述转录因子或转录活化因子包括通用转录因子和 调控性转录因子，其中通用转录因子与RNA聚合酶一起构成了转录 机器，通过与DNA转录起点临近位点启动子区结合实现基因转录； 调控性转录因子一般与多样的增强子序列结合，再与转录机器发生作 用，调控基因的转录；所述转录因子例如为p53、c-myc、p300；所述 转录活化因子例如为转录活化因子-3（STAT3）、转录活化因子-1 （STAT1）等。

在本发明中，所述目标DNA分子可以为任何感兴趣的DNA分子， 例如可以为任何感兴趣序列，例如为任何感兴趣的基因的调控基因部 分（例如启动子序列，增强子序列）。在本发明的实施方案中，所述 目标DNA分子为基因的启动子序列或其部分序列。

在本发明中，所述非特异DNA分子可以为任何能够与组蛋白结 合的DNA双螺旋分子，例如为与目标DNA分子不同的DNA分子， 例如为基因组中的外显子DNA部分，例如为目标DNA分子的基因外 显子DNA部分。

在本发明中，所述能够与组蛋白结合的DNA分子是指该DNA分 子所携带的负电荷足以与组蛋白结合以形成DNA-组蛋白复合物；优 选地，该DNA分子能够被标记分子所标记。

在本发明中，所述非特异DNA分子的长度例如为大于100bp，例 如为大于200bp。

在本发明中，所述外显子DNA是指编码蛋白质序列的基因的 DNA序列。

在本发明中，所述调控基因是指调控基因转录的DNA序列。

发明的有益效果

本发明的方法具有稳定性和重复性好的特点，显著提高了鉴定未知 DNA结合蛋白的实验效率。为深入研究细胞基因转录调控、基因转录的 分子行为、分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科提供了有益的帮 助。

附图说明

图1：整个分离纯化及鉴定过程模式图。

引物5’端标记上生物素后进行PCR扩增出目的片段。引入一段与 目的片段相当的随机对照片段以除去核组分中高丰度的蛋白，如组蛋 白。将对照片段与链霉亲和素磁珠孵育，使片段5’端带上磁珠，再加入 核组分蛋白中进行孵育，使对照片段与核组分充分结合，通过磁力系统 分离出对照片段结合的大部分非特异高丰度蛋白。然后将去除过高丰度 蛋白的核组分再与目的片段孵育，抓取片段特异结合的蛋白分子，将这 些蛋白洗脱后走胶银染，发现其中的特异性条带，切胶进行质谱鉴定。

图2：经过富集和未经过富集的SDS-PAGE图。其中BC8S为未 经过与非特异片段（对照片段）孵育的电泳结果，BM5为经过与未特 异片段孵育的电泳结果。其中BM5P2是指将核组分进行了一次对照片 段去除高丰度蛋白后的电泳结果，BM5P3是指将核组分进行了两次对 照片段去除高丰度蛋白后的电泳结果。可以看到与未进行富集的组 BC8S相比，BM5P2和BM5P3大部分条带有逐渐加强的趋势，如 35-40kDa之间的条带。

图3：SDS-PAGE及质谱鉴定结果图

如图所示（其中BC8S、BM5P2和BM5P3的含义与图2相同）,基 于DIP方法富集了BM5P3片段特异结合的蛋白。取上图箭头所指处的 特异性条带，切胶,进一步质谱鉴定。中图为鉴定样本的一级分离谱图， 箭头框包括的部分是我们感兴趣的其中一个肽段所处在的分离位置，下 图为该蛋白的二级质谱图，经过搜库该肽段对应的蛋白是PURA（核转 录因子）。

图4：DNA与PURA的相互作用

Western blotting分析验证了特异DNA序列与PURA（PURα）的 相互作用，食管癌细胞系KYSE510细胞核蛋白提取，经DIP方法免疫 共沉淀，免疫印迹分析验证质谱的鉴定的转录因子PURA，文献调研发 现PURA与E2F家族有相互调控关系，免疫印迹验证了该特异DNA序 列与PURA和E2F-2蛋白都具有相互作用。

图5：DNA与PARP的相互作用

Western blotting分析验证了特异DNA序列与PARP-1的相互作 用，图中NP为未经处理的食管癌细胞系KYSE510细胞核组分蛋白， 1～4为经过非特异序列去除高丰度蛋白，再经目的的DNA序列结合的 蛋白复合体组分。经DIP免疫共沉淀，免疫印迹分析验证了核因子 PARP-1与特异DNA的相互作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1：采用DNA免疫共沉淀联合质谱鉴定PURA转录因子

1.核组分蛋白的提取

1)使用T75培养瓶培养食管癌细胞KYSE510（由日本Kyoto 大学Shimada教授惠赠），使用4℃预冷的1×PBS洗细胞，10ml/次×1 次。用胰酶消化下来后，完全培养基（RPMI1640,含10%胎牛血清） 10ml终止胰酶翻译，PBS10ml/次×2次洗细胞，弃掉PBS留下沉淀细 胞；用1mL Buffer A（10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl₂,10mM  NaCl,0.5mM DTT）重悬细胞，置于冰上15min；

2)在步骤1）的细胞悬液中加入终浓度0.3%NP40裂解液（50mM  Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1%NP-40），混匀后将细胞悬液加入匀浆 器中，上下匀浆20次；

3)匀浆后，将细胞裂解悬液至228g，4℃离心10min，弃去上清；

4)用300μl Buffer B(0.3M sucrose（蔗糖）,10mM HEPES, pH7.9,5mM MgCl₂,10mM NaCl)重悬细胞核沉淀，在另一个管中 加入900μl buffer C（1.8M sucrose,10mM HEPES,pH7.9,5mM MgCl₂,10mM NaCl），将重悬液加到buffer C中；

5)4℃条件下，25000g离心35min，弃掉上清，小心保留沉淀；

6)加入1ml Buffer B洗两遍沉淀；

7)取1ml左右Buffer D(10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl₂,0.42M NaCl,0.5mM DTT,0.3M sucrose,0.5%Triton X-100) 加入蛋白酶抑制剂（该蛋白酶抑制剂包括AEBSF、抑肽酶、抑氨肽酶、 亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、PMSF(氟化苯基甲磺酰氟)，Roche公司）， 裂解以上所得沉淀，涡旋震荡，4℃条件下，充分裂解；

8)将裂解液分装于两个1.5ml离心管中，4℃离心，15min。收 集上清，Bradford法蛋白定量。1mg/ml蛋白裂解液分装到1ml冻存 管中，冰上保存。

2.生物素标记DNA片段的制备

1)确定目标DNA片段和非特异DNA的序列，以及目标DNA 片段和非特异DNA片段的引物序列，合成引物，同时在5’端加上生 物素标记；

A.非特异DNA序列如下：

TCAGGCTTGTCAGGGGGATAACTACCAGAAAGGTATACCTGT TGAGACTGATTCAGAGGAGCAACCCTATTTAGAAATGGATTTA TCATCACCTCAAACGAGATATATCCCGGATGAGGCTGACTTTC TGCTGGGGATGGCCACTGTGAATAACTGTGTTTCCTACCGAAA CCCTGCAGAGGGAACCTGGTACATCCAGTCACTTTGCCAGAG CCTGAGAGAGCGATGTCCTCGGTAAGTTTTGCCTACTCAGCCC TCCTCACTGTTACACTACCTTCCCCCCCTACTCCATCACACTA CTATCTACTCATATTCAGAGCCTATTAGAAAGTGCTATGTGAT TTAGATCACATTAACAGGTCAGAGAACTGTCCAAGGGGAGTG GTTTCCGTTCAACTCTAAATGTCTAGCTGTAGATCACATAGCT GCATTTCCCAGGTCAGTTACAAAGTGGGAGAGTGGCAAGTGT TAACATCCTTAGTTTATAGATGGAAAAGCTGAGATGCTTTATT CCTTTATTCAGCACCTCAAAGGACAATCAGGGTATCACAGAGC AGGAAAGGATAGGAAAGTCATATACTCCAGCTCTCTGTCTTTA GGCCAAAACATGACTGAGCCAATTCAACTAGTTTTGGAAATCT TCCAAGAAGGCAGTAACCCAATTCAATGTTTAAACATCCTCCA ACTCTGTCAAAAGTTCTATAATAGCAAACCATCCTCAAAACCT CTTGGTGCATTATGGGAGATAAATAGCAGGTTCCTTCTAGCCC TGTATTTCATGTTTTGAGTATATGAAGAGTGAGAATTTCCCGT AACTTAGATCATGAATCTAACTTAGATTTCGTAACTTAGATCA TGAATCCTGCAAGGTTTCCGCGGCTAGCTACCAAGGTAGAAG AAGAGGTTGCCTAACAAAAATGCTAAGAGATCCTGGTGAGAA GAAGGTGGGAGTAGCTGCAG（SEQ ID NO：1）

其引物序列分别为

上游引物：5'-TCAGGCTTGTCAGGGGGATA-3'（SEQ ID NO：2）

下游引物：5'-CTGCAGCTACTCCCACCTTC-3'（SEQ ID NO：3）

B.目的DNA为Caspase8基因的启动子序列，其序列如下：

GGGTCTAGGGCTCAGAGCTTTGGAGAACAGACCTCAGTAG CACCAACACTCCAGGATCAATGCTACAAAGACACGGGTTAC AACTAAACTGGAGAACATGGCCAAGGATGGGAACTCAGCC TGAGCAGGGCTGAGCCGAGCAGGGCTAAGCCAAGTAGGGC TGAGCCAGAACACTTCCTCCTTTTTTCTGAACAATCTACCT ACATTTCAGCTACAGGGCTGGCTTTACCCAGTCCGGCGGG AGGGAGGAGAGGGCTGGTCTGTGACTTCAGTGCTGAGGTT TGATCAAGGCAAAGGGAAACTTCCTATTCCCAGACCCTTTG CAAGAAAGAATGGCATATTACTTGCCACCGACAGGGGTTAT TATTACTAAATGGAGTCAGTATAAATGCTTTCCAATAAAGC ATGTCCAGCGCTCGGGCTTTAGTTTGCACGTCCATGAATTG TCTGCCACATCCCTCTTCTGAATGGTTGGAAATTGGGCATC TGTTCCTTTAAACAGGAAACATTTCTTGTTCGAGTGAGTCA TCTCTGTTCTGCTTTAGGAGTAAAGTTTACCCTGCAGTTCC TTCTGTGGTGAAGTTTTCTCTTTCTCTCGGAGACCAGATTC TGCCTTTCTGCTGGAGGGAAGTGTTTTCACAGGTTCTCCTC CTTTTATCTTTTGTGTTTTTTTTCAAGCCCTGCTGAATTTGC TAGTCAACTCAACAGGAAGTGAGGCCATGGAGGGAGGCAG AAGAGCCAGGGTGGTTATTGAAAGTA[A/G]AAGAAACTTCT TCCTGGGAGCCTTTCCCACCCCCTTCCCTGCTGAGCACGTG GAGTTAGGCAGGTTAGGGGACTCGGAGACTGCGATGGTGC CAGGAAAGGGTGGAGCGGGTGAGTGCCTGTTGCCAAGGTG GCCTCTTCAACAGGAAACCACAATATTTTTGTTTCTTGACTT GCTCTAGAAACAGGGCTGTGGGGGTGGGGAAGCAACTTGG ATCTGCCCTTCTGAGGACACCTCTGGGTGCTGCCTGGCCCA GGTCTCCTGTGTGGTTTCTCTCTGAGCCGTTGCCTCTGACT TTGCTACTTTTTCACTCTGAGCAGTCTCCAGTTCCTCTGCTA CCTTTTTGTCCTCCAAGCTTCCCTGCCGCCTCGAATGCAGA TACACGGTCTCCCTCCTGTGGACCCGTTTGGAGAGTCCAGA AGACTTTATCAATCCACTTTTTTTTCTTTTTCATTTGGCCCT GGGGCCGACGGTTAAGTACTTTATTCTGTCATTCTGTCGAA TCACGATGCCCTGAGGTGCACAGCCCCTTCCCCCTCTTCCG TGTCTGAAGGGTTTCCTTTTATCTCTCCACCCCCACCCTTG CCCTCCTGCCCTCTCTCTTGTTCCCCAAAGACAGTTCTCTA ATGTTTTGATGTGGATTCGTGAATTTATCTGTATCTTTGCAA AATGTATTTTTCTTTTGTATGTGTACACTGTTTTTTAACTAT GCGATCTCAGGCAAGTAATTCCTCTGTGCCTCTGTTATCTC ATCATTAAATGATTAATAATGCCTCCAGAGGTGACTG（SEQ  ID NO：4）

引物序列分别为

上游引物：5‘-GGGTCTAGGGCTCAGAGCTT-3’（SEQ ID NO： 5）

下游引物：5‘-CAGTCACCTCTGGAGGCATT-3’（SEQ ID NO： 6）

2)以食管癌细胞KYSE510的基因组DNA为模板，PCR反应 扩增，得到PCR产物A（SEQ ID NO：1所示的非特异DNA片段） 和PCR产物B（SEQ ID NO：4所示的特异DNA片段）；

3)PCR产物经试剂盒纯化去除多余三磷酸核苷酸、酶、盐离子 等。

3.DNA免疫共沉淀（DIP）分离纯化DNA结合蛋白

1)将商品化的链霉亲和素磁珠（GE公司）先行混匀，取链霉 亲和素磁珠30μl beads原液放入1.5ml离心管中，加入1ml的预冷 TBS（50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5），洗2～3次；

2)取30μl上面预处理好的链霉亲和素磁珠，加入生物素标记好 的PCR产物A（非特异性DNA片段），4℃下在旋转仪（rotator） 上孵育15min；

3)经磁力架固定住结合了DNA片段的珠子，小心地吸去上清， 加入TBS洗1～2次；

4)向适量核组分蛋白裂解液（10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,0.42M NaCl,0.5mM DTT,0.3M sucrose,0.5%Triton  X-100）中加入一倍体积的TBS作为结合buffer，并加入上述PCR产 物A偶联磁珠，4℃条件下，反转孵育旋转3hours；将上述经过竞争 性DNA结合过的核组分，再按照2-4步处理一遍；

5)吸取并保留经PCR产物A偶联磁珠处理过的细胞核组分蛋 白裂解液，弃去磁珠成份（即保留未与PCR产物A偶联磁珠结合的 细胞核组分蛋白裂解液），重新加入带生物素标记PCR产物B的DNA 片段，4℃条件下，旋转孵育过夜；即将PCR产物B偶联到链霉亲和 素磁珠上；

6)经磁力架固定住结合了DNA片段的珠子，小心地吸去上清， 300mM NaCl的TBST洗涤珠子5mins，重复三次；

7)通过磁力架固定磁珠，加入60μl2%SDS，洗脱DNA片段 上结合的蛋白，室温旋转15mins；将洗脱产物转移至EP管，-80℃保 存备用。

4.银染寻找差异蛋白条带

1)将以上洗脱产物走4%-12%梯度SDS-PAGE胶分离，120V， 4℃，上样量5μl左右；银染过程及染液配方如下（括号内体积数为每 块胶的推荐用量）：

2)固定液（10%冰醋酸，40%乙醇）：反应30min

3)增敏液反应30min（乙醇150ml，醋酸钠34g，戊二醛（50%）， 硫代硫酸钠1g（用前加），加水至500ml）

4)水洗：双蒸水3×5min

5)银反应：20min（0.25%硝酸银，40%甲醛）

6)水洗：双蒸水2×1min

7)显色液：2～5min（2.5%无水碳酸钠，20%甲醛）

8)终止液：10min（EDTA7.3g加水至500ml）水洗：3×5min

根据银染结果，与对照组比较确定差异条带，并用刀片切下保存 到EP管，以备后续质谱鉴定。

5.质谱鉴定差异条带成分

1)将银染后切下的含差异条带的胶条，进行质谱鉴定，比如 Thermo Orbitrap Q Exactive；

2)得到质谱原始数据后，利用MASCOT等工具搜库比对，确 定鉴定蛋白类型；

3)依据MASCOT得分，确定可信度及具有转录功能的蛋白。

结果：

整个分离纯化及鉴定过程如图1所示，引物5’端标记上生物素后进 行PCR扩增出非特异片段和目的片段。将非特异片段与链霉亲和素磁 珠孵育，使片段5’端带上磁珠，加入核组分蛋白中进行孵育，使非特异 DNA片段与核组分充分结合，通过磁力系统分离出对照片段（即非特 异片段）结合的大部分非特异高丰度蛋白。然后将去除过高丰度蛋白的 核组分再与目的片段孵育，抓取片段特异结合的蛋白分子，将这些蛋白 洗脱后走胶银染，发现其中的特异性条带，切胶进行质谱鉴定。

经过两次对照片段去除高丰度蛋白的结果如图2所示：BC8S为本 实验对照组，即未去除高丰度蛋白的电泳结果，BM5为实验组，即去 除高丰度蛋白后的电泳结果；

BM5P2是指对核组分进行了一次对照片段去除高丰度蛋白的后的 电泳结果，BM5P3是指与对核组分进行了两次对照片段去除高丰度蛋 白后的电泳结果。可以看到与未进行富集的组BC8S相比，BM5P2和 BM5P3大部分条带有逐渐加强的趋势，如35-40kDa之间的条带。

SDS-PAGE及质谱鉴定结果图如图3所示，基于DIP方法富集了 BM5P3片段特异结合的蛋白。上图箭头所指处的特异性条带，切胶,进 一步质谱鉴定。中图为鉴定样本的一级分离谱图，箭头框包括部分是我 们感兴趣的其中一个肽段所处在的分离位置，下图为该蛋白的二级质谱 图，经过搜库该肽段对应的蛋白是PURA（Adenylosuccinate Synthetase， 腺苷酸琥珀酸合成酶）。PURA蛋白是嘌呤富集DNA结合转录因子， 是一种DNA单链结合蛋白，主要结合于复制起始的嘌呤富集区域，调 控DNA复制与转录。

Western blotting进一步分析验证了目标DNA序列与PURA的相 互作用，如图4所示，食管癌细胞系KYSE510细胞核蛋白提取物，经 DIP方法免疫共沉淀，经SDS-PAGE电泳，免疫印迹分析，验证了质 谱鉴定的转录因子PURA与特异DNA序列具有相互作用。文献调研发 现PURA与E2F家族有相互调控关系，因此还同时免疫印迹验证了 E2F-2蛋白与目标DNA的相互作用（图4）。

实施例2：采用DNA免疫共沉淀技术Western blotting鉴定PARP 转录因子

1.核组分蛋白的提取

使用T75培养瓶培养细胞KYSE510，使用4℃预冷的1×PBS洗细 胞，10ml/次×1次。用胰酶消化下来后，完全培养基10ml终止胰酶翻 译，PBS10ml/次×2次洗细胞，弃掉PBS留下沉淀细胞；用1mL Buffer A（10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,10mM NaCl,0.5mM DTT） 重悬细胞，置于冰上15min；

1)在步骤1）的细胞悬液中加入NP40裂解液至终浓度0.3%， 混匀后将细胞悬液加入匀浆器中，上下匀浆20次；

2)匀浆后，将细胞裂解悬液至228g，4℃离心10min，弃去上清；

3)用300μl Buffer B(0.3M sucrose,10mM HEPES,pH7.9,5 mM MgCl2,10mM NaCl)重悬细胞核沉淀，在另一个管中加入900μl buffer C（1.8M sucrose,10mM HEPES,pH7.9,5mM MgCl2,10mM NaCl），将重悬液加到buffer C中；

4)4℃条件下，25000g离心35min，弃掉上清，小心保留沉淀；

5)加入1ml Buffer B洗两遍沉淀；

6)取1ml左右Buffer D(10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,0.42M NaCl,0.5mM DTT,0.3M sucrose,0.5%Triton X-100) 加入蛋白酶抑制剂（该蛋白酶抑制剂包括AEBSF、抑肽酶、抑氨肽酶、 亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、PMSF(氟化苯基甲磺酰氟)），裂解以 上所得沉淀，涡旋震荡，4℃条件下，充分裂解；

7)将裂解液分装于两个1.5ml离心管中，4℃离心，15min。

收集上清，Bradford法蛋白定量。1mg/ml蛋白裂解液分装到1ml 冻存管中，冰上保存。

2.生物素标记DNA片段的制备

1)确定目标DNA片段和非特异DNA的序列，以及目标DNA 片段和非特异DNA片段的引物序列，合成引物，同时在5’端加上生 物素标记；

A.非特异DNA片段及其引物的序列同实施例1。

B.目的DNA为Caspase8基因的启动子序列的一部分，其序 列如下：

CCTGCAGTTCCTTCTGTGGTGAAGTTTTCTCTTTCTCTCGGAG ACCAGATTCTGCCTTTCTGCTGGAGGGAAGTGTTTTCACAGGT TCTCCTCCTTTTATCTTTTGTGTTTTTTTTCAAGCCCTGCTGAA TTTGCTAGTCAACTCAACAGGAAGTGAGGCCATGGAGGGAGG CAGAAGAGCCAGGGTGGTTATTGAAAGTA[A/G]AAGAAACTTC TTCCTGGGAGCCTTTCCCACCCCCTTCCCTGCTGAGCACGTGG AGTTAGGCAGGTTAGGGGACTCGGAGACTGCGATGGTGCCAG GAAAGGGTGGAGCGGGTGAGTGCCTGTTGCCAAGGTGGCCTC TTCAACAGGAAACCACAATATTTTTGTTTCTTGACTTGCTCTA GAAACAGGGCTGTGGGGGTGGGGAAGCAACTTGGATCTGCCC TTCTG（SEQ ID NO：7）

引物序列如下：

上游引物：5‘-CCTGCAGTTCCTTCTGTGGT-3’（SEQ ID NO：8）

下游引物：5‘-CAGAAGGGCAGATCCAAGT-3’（SEQ ID NO：9）

2)以细胞KYSE510的基因组DNA为模板，PCR反应扩增， 得到PCR产物A（SEQ ID NO：1所示的非特异DNA片段）和PCR 产物B（SEQ ID NO：7所示的特异DNA片段）；

3)PCR产物经试剂盒纯化去除多余三磷酸核苷酸、酶、盐离子 等。

3.DNA免疫共沉淀（DIP）分离纯化DNA结合蛋白

1)将商品化的链霉亲和素磁珠先行混匀，取链霉亲和素磁珠 30μl beads原液放入1.5ml离心管中，加入1ml的预冷TBS（50mM  Tris，150mM NaCl，Ph7.5），洗2～3次；

2)取30μl上面预处理好的链霉亲和素磁珠，加入生物素标记好 的PCR产物A（非特异性DNA片段），4℃下在旋转仪（rotator） 上孵育15min；

3)经磁力架固定住结合了DNA片段的珠子，小心地吸去上清， 加入TBS洗1～2次；

4)向适量核组分蛋白裂解液（10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,0.42M NaCl,0.5mM DTT,0.3M sucrose,0.5% Triton  X-100）中加入一倍体积的TBS作为结合buffer，并加入上述PCR产 物A偶联磁珠，4度条件下，反转孵育旋转3hours；将上述经过竞争 性DNA结合过的核组分，再按照2-4步处理一遍；

5)吸取并保留经PCR产物A偶联磁珠处理过的细胞核组分蛋 白裂解液，弃去磁珠成份（即保留未与PCR产物A偶联磁珠结合的 细胞核组分蛋白裂解液），重新加入带生物素标记PCR产物B的DNA 片段，4℃条件下，旋转孵育过夜；即将PCR产物B偶联到链霉亲和 素磁珠上；

6)经磁力架固定住结合了DNA片段的珠子，小心地吸去上清， 300mM NaCl的TBST洗涤珠子5mins，重复三次；

7)通过磁力架固定磁珠，加入60μl2%SDS，洗脱DNA片段 上结合的蛋白，室温旋转15mins；将洗脱产物转移至EP管，-80℃度 保存备用。

8)免疫印迹检测DNA免疫共沉淀蛋白。

已知聚ADP核糖聚合酶-1（Poly(ADP-ribose)polymerase-1， PARP-1）与Caspase8存在相互作用，我们利用Western blotting 分析进一步验证了目标DNA序列与PARP-1之间的相互作用，结 果如图5所示，图中NP为食管癌细胞系KYSE510细胞核组分蛋 白，1～4为经过去除高丰度蛋白后的富集核组分。经DIP免疫共沉 淀，免疫印迹分析，验证了核因子PARP-1与目标DNA序列存在 相互作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。