摘要:
【目的】制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1(rFgCat L1)特异性单克隆抗体,并构建其双抗体夹心ELISA检测方法。【方法】用1 mg/mL rFgCat L1蛋白分4次对5只BALB/c小鼠进行免疫,分离小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合构建杂交瘤细胞,筛选强阳性杂交瘤细胞株,每只小鼠腹腔注射1×10^(6)个细胞制备单克隆抗体。ELISA法检测抗体效价及抗原表位,Western blotting法鉴定抗体亚型和特异性;结合抗rFgCat L1多克隆抗体构建双抗体夹心ELISA检测方法,并检测其敏感性和特异性;用建立的方法对20份阴性血清及阳性血清对照进行检测,筛选其阴阳临界值,并用47份山羊阳性血清及47份奶牛阳性血清对所构建的双抗体夹心ELISA方法进行验证。【结果】免疫后,4只小鼠血清中抗体效价均>10^(4);取小鼠脾细胞与SP2/0融合后,共筛选到8株阳性杂交瘤细胞株,其中5D5和7G6为可稳定分泌抗体的强阳性株,抗体效价分别达2^(9)和2^(10),腹水效价分别达10^(7)和10^(8)。经Western blotting鉴定2株抗体均为IgG1型,轻链为Kappa型,均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretory product,ESP)。由于2株抗体识别相同抗原位点,对比2株单抗的抗体效价,选择以7G6作为捕获抗体,抗rFgCat L1多克隆抗体作检测抗体构建双抗体夹心ELISA法。双抗体夹心ELISA法条件为:7G6以2μg/mL浓度包被,抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶4000,5%脱脂奶粉封闭,显色时间为25 min。经验证,该方法可识别的最低抗原浓度为0.625μg/mL,并且可特异性识别大片形吸虫抗原。利用构建的双抗体夹心ELISA方法对阳性的奶牛和山羊血清样本进行抗原检测,抗原检出率分别为72.3%及78.7%。【结论】本研究成功制备抗rFgCat L1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法,结果可为研发低成本、快速诊断试剂盒提供良好的理论依据及物质基础。