侧翼序列

摘要： 侧翼序列是指染色体中特定位点两侧的DNA序列,包含着候选基因、转录调控、染色体结构、生物安全等信息,在基因组学研究中具有重要的作用。侧翼序列获取技术主要应用于启动子和增强子等调控序列的克隆、鉴定T-DNA或转座子插入位点、染色体步移、全基因组空隙填补等,是结构基因组研究以及功能基因组研究的重要手段,在转基因动植物鉴定及安全管理等方面具有重要应用。随着分子生物学的发展,目前已经建立了许多侧翼序列的获取方法,依据技术原理可以分为质粒拯救法、反向PCR法、外源接头介导PCR法、半随机引物PCR法和基因组重测序法等5大类。本文系统总结了近年来侧翼序列获取技术的研究进展,并对这些技术的原理以及应用情况进行了较为系统的综述,为侧翼序列信息的获取提供参考。

摘要： 术和数据库管理技术相结合,实现DNA信息数字化存储、管理和检索的系统[1]。STR由于具有良好的多态性,现已成为法庭科学实践中所使用的重要遗传标记[2]。常染色体STR基因座是目前亲权鉴定和个体识别中运用最广泛的遗传标记,性染色体STR基因座以其独特的遗传特点在个体识别、亲子鉴定、血缘关系鉴定及族谱DNA分析等方面具有十分重要的研究和应用价值[3]。

摘要： 为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体.并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,T9、T11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;T1、T3、T4、T7、T9突变体生长速率比野生型nm-1快,而T11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入.并通过Hi TAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Lepto-sphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据.

摘要： [目的]明确SbHKT基因棉花HKT-1株系的插入位点序列特征.[方法]对HKT-1株系重测序,本地BlastN比对获得插入位点处的侧翼序列,设计聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)特异引物验证插入位点的准确性.[结果]获得SbHKT基因插入位点处107bp的左边界(Left border,LB)端侧翼序列HKT1_LSEQ,122bp的右边界(Right border,RB)端侧翼序列HKT1_RSEQ;锚定基因组后显示SbHKT基因的插入引发了陆地棉染色体结构变异.分别根据LB和RB端侧翼序列设计PCR特异引物扩增HKT-1株系T-DNA全长,目的条带含有完整的T-DNA骨架序列以及SbHKT基因序列,证实HKT1_LSEQ和HKT1_RSEQ是同一个插入位点的左右侧翼序列.[结论]基于重测序技术获得了 SbHKT基因在陆地棉基因组中的侧翼序列,建立了 SbHKT基因转化体特异性检测方法.

摘要： 【目的】从梨树腐烂病菌T-DNA插入突变体库中筛选鉴定致病缺陷突变体,并分离致病相关基因。【方法】利用农杆菌介导方法转化梨树腐烂病菌,获得504个T-DNA插入转化子,对其中250个转化子的致病力进行筛选。利用TAIL-PCR对致病力显著降低的突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列进行扩增和分析。【结果】与野生型菌株相比,4个转化子(T8、T12、T43和T75)在梨果实和枝条上致病力显著降低。扩增获得T8、T43和T75的T-DNA插入位点的特异侧翼序列,测序后经Blast比对序列结果显示,转化子T8、T43和T75 T-DNA分别插在含MSF结构域的蛋白基因、Zds1基因和假定的谷氨酸合成酶基因。【结论】构建了农杆菌介导的梨树腐烂病菌T-DNA插入突变体库,从中筛选获得4个致病力缺陷的突变体,并分析了致病力缺陷突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列,为下一步梨树腐烂病菌致病基因的克隆和功能研究奠定了基础。

摘要： [目的]建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持.[方法]根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性.调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件.将转基因大豆ZH10-6和受体中黄1 0的基因组DNA按质量比混合,制备成100％、50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％和0的DNA样品,进行灵敏度检测.运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价.[结果]建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、4 30、338、81 0和1 626 bp的特异性目标条带.用该方法扩增受体中黄1 0时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带.多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActinll F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P2 0.6 μL),ddH2O补足25 μL.多重PCR扩增最适程序为95°C 5 min;95°C 30 s,60°C 30 s,68°C 1 min 20 s,35个循环;72°C 12 min.该多重PCR体系灵敏度为0.5％,符合欧盟有关转基因产品标识的要求.该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系.[结论]建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系.

摘要： [目的]分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用.[方法]以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错PCR法(hiTAIL-PCR)分离外源基因插入位点侧翼序列,比对毛果杨基因组序列确定插入位点.根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性PCR检测引物,建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性PCR检测方法,并利用实时荧光定量PCR技术分析插入位点周边基因表达情况.[结果]PCR及半定量PCR结果表明,转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达.通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子,其碱基组成AT含量为65％;n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点,其碱基组成AT含量为69％.特异性PCR检测显示,n12能扩增出709 bp(转基因)和1 159 bp(非转基因)特异性条带,n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1 265 bp(转基因)和1 827 bp(非转基因)特异性条带,而对照仅能扩增非转基因特异性片段.n12 T-DNA插入造成插入位点的丝氨酸蛋白激酶(SPK) Potri.015G076600基因表达量上调4.3倍,而附近的共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM) Potri.015G076700表达量下调20倍,从而可能调节杨树生长速度.n222插入位点上下游基因异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6"-O-丙二酰转移酶(IBG) Potri.001G395700和光敏色素互作因子解旋酶(PIF) Potri.001 G395800表达量均上调.[结论]转BtCry1Ac欧洲黑杨T-DNA偏好插入富含AT区域,同时T-DNA载体边界序列缺失,并引起插入位点附近基因表达量变化.建立转BtCry1Ac欧洲黑杨特异性检测方法,为转BtCry1Ac欧洲黑杨的管理与监测提供参考.

摘要： 为明确转cry2Ab4基因抗虫棉(L280)与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉(L282)在棉花基因组中的插入位点.通过融合引物与巢式聚合酶链式反应(Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)的方法获取T-DNA的侧翼序列.分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61309969-61309997 bp区间和D11染色体11069019-11069039 bp区间.同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置.通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持.

摘要： 外源DNA片段的拷贝数及插入位点的侧翼序列等分子特征信息是转基因植物安全评价过程中必需要提供的信息.本研究利用基因组测序结合生物信息学对耐除草剂转基因水稻G2-7的T-DNA插入位点、拷贝数和侧翼序列进行鉴定.利用Illumina NovaSeq 6000平台对G2-7进行全基因组测序,共获得47.13 Gb的测序数据,通过与转基因载体和参考基因组序列的比较,确定了G2-7中T-DNA在受体基因组中的插入位点.结果显示,外源DNA片段以单位点单拷贝形式插入到水稻1号染色体的36,189,491～36,189,507位置,造成水稻基因组16 bp DNA缺失,无载体骨架的插入.同时我们获得外源基因插入位点5′侧翼序列375 bp和3′端侧翼序列353 bp,并通过PCR扩增和Sanger测序进一步证明获得的侧翼序列是正确的.研究结果为转基因水稻G2-7的安全评价及转化体特异性检测提供了有效的数据支撑,同时也证明全基因组测序(WGS)是解析转基因植物分子特征的有效方法.

摘要： [目的]明确转GbVe1基因棉花的插入位点序列特征.[方法]Southern杂交筛选低拷贝基因插入的转基因棉花株系,以hiTAIL-PCR(Polymerase chain reaction)获取其T-DNA侧翼序列,然后根据获得的T-DNA侧翼序列设计特异PCR引物,验证插入位点的准确性.[结果]Southern杂交候选了T-DNA低拷贝插入的3个转基因棉花株系,hiTAIL-PCR分离到RB端侧翼序列(119～1 018bp)、LB端侧翼序列(243～516 bp);侧翼序列的AT碱基含量在63％以上.转基因株系7/100826-152和12/100826-393插入位点都位于Gohir.D01G157600.1内含子上.转基因株系1/w-ch14插入位点分别位于Gohir.D01G157600.1内含子和A12染色体的基因间隔区中.T-DNA在Gohir.D01G 157600.1内含子的插入事件造成了21 bp碱基的基因组序列缺失.T-DNA到侧翼序列的PCR产物证明Gohir.D01G 157600.1上的插入位点真实可靠.[结论]hiTAIL-PCR获取了转GbVe1基因棉花的T-DNA侧翼序列,提供了T-DNA插入位点位于Gohir.D01G 157600.1基因内含子的特异性检测引物.

摘要： 利用SMART cDNA和RACE-PCR技术对萍乡红鲫卵母细胞透明带糖蛋白ZP3基因进行克隆。克隆得到萍乡红鲫ZP3基因cDNA全长序列1383bp，其中22-1335bp为萍乡红鲫ZP3的完整开放阅读框，总共编码437个氨基酸。利用基因组步移技术，步移萍乡红鲫ZP3基因DNA序列2141bp，其中包含了7个外显子序列，6个内含子序列，并获得了ZP3基因5’端侧翼序列1207bp。以绿色荧光蛋白(greenfluoresgent protein，GFP)为报告基因，成功构建了2个萍乡红鲫ZP3基因5’端侧翼序列缺失片段的表达载体。

摘要： 多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是优良的牧草和草坪草，由于自交不亲和，传统遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术给其遗传改良带来希望。本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，对多年生黑麦草进行遗传转化。材料选用多年生黑麦草品种爱神特、超级德比、德比、金牌美达丽、神枪手、多福和绿宝石成熟种子。用从成熟胚诱导的愈伤组织进行转化。农杆菌菌株EHAl05，携双元载体质粒pCAMBIA2301。经农杆菌侵染、巴龙霉素筛选，获得抗性植株。经PCR、GUS组织染色和Southern bloting验证，结果表明从金牌美达丽、神枪手和多福中获得了稳定表达的转基因多年生黑麦草植株。并应用接头盒连接巢式PCR技术进行T-DNA侧翼序列的扩增和分析，获得2个整合T-DNA左边界侧翼序列。序列分析显示，T-DNA插入到宿主基因组中.左边界序列发生了不同程度的缺失，这种现象与转基因拟南芥、水稻、大麦中一致。转化系统的建立，为定向进行分子设计改良黑麦草品种，打下基础.

摘要： 本发明公开了一种一次分离多个已知序列DNA片段的未知侧翼序列的方法。该方法巧妙利用了Tn5转座酶复合体可以在打断DNA的同时，将DNA接头连接到打断的DNA片段上的特性，理论上，基因组DNA只要能够被打断，其断点处都会被连接上DNA接头，连接DNA接头的效率近乎100%，远远高于反向PCR、接头PCR、TAIL‑PCR等同类技术，结合第二代高通量测序技术，可以同时分离一个样品中多个已知序列DNA片段的侧翼序列，而且可以从其左右两侧同时进行。对同一个已知序列DNA片段，同时从左右两端分离其侧翼序列，可以提高侧翼序列的分离效率，如果能够同时分离到其左右两侧的侧翼序列，它们可以互相验证，提高准确度。

摘要： 一种用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，包括构建文库、侧翼序列捕获及测序三部分。采用了定点突变PCR的方法，在已知序列上设计合适的引物（不需有突变位点），以构建的文库为模板，从文库中众多的质粒中筛选到含有已知序列位点的DNA片段，通过PCR方法在质粒库中筛选出靶位点，进而得到插入序列为2Kb-5Kb，含有已知序列的质粒库，并依此为靶点得到其两侧侧翼序列。本发明提供的测序方法实现了对基因组的全貌获取，解决了研究人员在对基因进行全面研究时无法对其全貌进行描述，进而无法精确研究其功能的技术限制，有利提高了相关研究的效率。

摘要： 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1‑2外源插入片段侧翼序列及其应用。本发明公开了一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1‑2外源插入片段侧翼，左边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:1所述；右边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:2所述。提取转基因大豆事件ZHs1‑2基因组DNA，利用基因组重测序技术分析确定外源片段插入位点，并通过PCR扩增获得。其用途是检测待测样品是否含有来源于ZHs1‑2的成分。

摘要： 本发明提供一种耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列及其应用，属于植物生物技术领域。具体地，涉及一种耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列及其应用。本发明公开的转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ‑2所示，右边界侧翼序列如SEQ‑3所示。本发明公开的转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列可以用作目标DNA序列，建立该转基因事件特异性检测方法。本发明提供的外源插入片段侧翼序列及检测方法适用于对该转基因大豆事件包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品的特异性检测。

摘要： 本发明公开了一种一次分离多个已知序列DNA片段的未知侧翼序列的方法。该方法巧妙利用了Tn5转座酶复合体可以在打断DNA的同时，将DNA接头连接到打断的DNA片段上的特性，理论上，基因组DNA只要能够被打断，其断点处都会被连接上DNA接头，连接DNA接头的效率近乎100%，远远高于反向PCR、接头PCR、TAIL‑PCR等同类技术，结合第二代高通量测序技术，可以同时分离一个样品中多个已知序列DNA片段的侧翼序列，而且可以从其左右两侧同时进行。对同一个已知序列DNA片段，同时从左右两端分离其侧翼序列，可以提高侧翼序列的分离效率，如果能够同时分离到其左右两侧的侧翼序列，它们可以互相验证，提高准确度。

摘要： 本发明提供了一种提供基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法，合成的接头引物能够互补且具有与某些酶切位点相同粘端，通过变性退火反应形成对应酶切位点的连接接头。此外本发明还公布了边酶切边连接构建目的基因侧翼序列文库的方法，通过2‑3轮巢式PCR精确的分离出目的基因的侧翼序列，可以解决无基因组参照动植物获得基因组信息困难、耗时、以及精准度较差等难题，同时，该方法对待分离基因所属的物种没有选择性，其核心技术环节接头的制备有多种变化模式，且能够通过电泳等方法快速简单的鉴别假阳性，能够高效、快速、廉价的从未知基因组中分离出目标基因的序列信息。

摘要： 本发明涉及一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性接头序列及其分离方法。该接头序列为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：4所示的碱基序列。利用这些接头序列与经过相应的限制性内切酶酶切的Ac/Ds转座系DNA连接后，利用Ac特异性引物和接头序列特异性引物可以很好扩增获得基因组中的Ac/Ds的侧翼序列。这种检测方法操作简单，为大规模的获得Ac突变体的Ac侧翼序列和分离Ac插入突变体的基因的重要的技术手段。

摘要： 一种用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，包括构建文库、侧翼序列捕获及测序三部分。采用了定点突变PCR的方法，在已知序列上设计合适的引物（不需有突变位点），以构建的文库为模板，从文库中众多的质粒中筛选到含有已知序列位点的DNA片段，通过PCR方法在质粒库中筛选出靶位点，进而得到插入序列为2Kb-5Kb，含有已知序列的质粒库，并依此为靶点得到其两侧侧翼序列。本发明提供的测序方法实现了对基因组的全貌获取，解决了研究人员在对基因进行全面研究时无法对其全貌进行描述，进而无法精确研究其功能的技术限制，有利提高了相关研究的效率。

摘要： 本发明涉及一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用。本发明发现circEXOC6B外显子的两侧近端的一对短的互补序列可以有效促进circEXOC6B成环，且对于circEXOC6B环化是必要的，而且将该序列连接到其他外显子两侧，仍然可以促进该外显子的环化，提示该对短序列对促进线性结构的外显子环化具有普适性。本发明证明了短反向互补序列同样能够高效的促进环状RNA的环化，揭示了环状RNA成环的新机制，并有望降低人工合成环状RNA的成本。

摘要： 本发明公开了一种快速高效的DNA5’侧翼序列克隆方法，包括以下2个主要步骤：(1)待测样本为模板，通过不同LAD引物组合与基因特异性R引物配对，使用热不对称交错PCR的方法进行第一轮PCR扩增；(2)以不同稀释倍数的第一轮PCR扩增产物作为模板，结合巢式PCR的引物设计方法，使用通用引物AC1与设计在第1轮特异性R引物上游的不同基因特异性R引物配对，通过热不对称交错PCR的方法进行第二轮PCR扩增。配合判断方法能够快速鉴别正确扩增条带范围，在原HiTail‑PCR的基础上由3轮扩增缩减为2轮扩增，且可由特异引物之间的已知间隔距离快速锁定特异扩增并排除部分非特异扩增，大幅减少非特异扩增带来的干扰。