简并引物

摘要： 目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233~240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况。结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58%的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6%,3T3细胞的感染效率为47.4%;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92%的组合突变(9898/11520)。结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85%的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库。

摘要： 浮游藻类在河流生态系统中发挥着重要的生态功能.为探明乌江流域不同梯级水库中浮游藻类的种群结构特征,采集了乌江流域某水库水深分别为0,10和45 m的水样过滤膜分层样本,利用两对浮游藻类通用简并引物对水样进行23S rRNA基因扩增、扩增片段建库和高通量测序分析.通过对两对引物获得的浮游藻类种群覆盖度比较,选择出了相对高效的分子标记,获得了不同水深水体中浮游藻类群落结构组成的初步信息,为进一步深入研究乌江流域不同梯级水库中浮游藻类物种多样性提供了一种新手段.

摘要： 浮游藻类在河流生态系统中发挥着重要的生态功能.为探明乌江流域不同梯级水库中浮游藻类的种群结构特征,采集了乌江流域某水库水深分别为0,10和45 m的水样过滤膜分层样本,利用两对浮游藻类通用简并引物对水样进行23S rRNA基因扩增、扩增片段建库和高通量测序分析.通过对两对引物获得的浮游藻类种群覆盖度比较,选择出了相对高效的分子标记,获得了不同水深水体中浮游藻类群落结构组成的初步信息,为进一步深入研究乌江流域不同梯级水库中浮游藻类物种多样性提供了一种新手段.

摘要： 目的:从基因水平上挖掘新的卤代酶类抗生素.方法:利用简并引物快速筛选缬草放线菌中含卤代酶类抗生素的目标菌株,并对其进行鉴定.选择萘啶酮酸、氯霉素、潮霉素、卡那霉素、红霉素、庆大霉素、阿普霉素等7种抗生素进行抗生素敏感试验,选择目标菌株的最适抗生素及其最适浓度,构建遗传转化系统.结果:从145株缬草放线菌中筛选到1株含卤代酶类抗生素生物合成基因的菌株AJ56,经鉴定其为链霉菌,在最适抗生素萘啶酮酸和阿普霉素的培养基中构建遗传转化系统,经多次传代,成功构建了菌株AJ56与大肠杆菌S17-1/pSET152遗传转化系统.结论:菌株AJ56遗传转化系统的成功构建为进一步研究其次级代谢产物提供了基础.

摘要： 目的:从基因水平上挖掘新的卤代酶类抗生素.方法:利用简并引物快速筛选缬草放线菌中含卤代酶类抗生素的目标菌株,并对其进行鉴定.选择萘啶酮酸、氯霉素、潮霉素、卡那霉素、红霉素、庆大霉素、阿普霉素等7种抗生素进行抗生素敏感试验,选择目标菌株的最适抗生素及其最适浓度,构建遗传转化系统.结果:从145株缬草放线菌中筛选到1株含卤代酶类抗生素生物合成基因的菌株AJ56,经鉴定其为链霉菌,在最适抗生素萘啶酮酸和阿普霉素的培养基中构建遗传转化系统,经多次传代,成功构建了菌株AJ56与大肠杆菌S17-1/pSET152遗传转化系统.结论:菌株AJ56遗传转化系统的成功构建为进一步研究其次级代谢产物提供了基础.

摘要： cry1A基因编码苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白,是转基因植物使用最为广泛的抗虫基因,包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、cry1Ab/Ac等类型,cry1A基因为靶标的检测方法在转基因植物安全监管与检测中尤为重要。虽已建立数种cry1A基因检测方法,但均因该基因间序列差别较大而无法覆盖大部分转化体。由此,采用简并引物的策略,开发了一种cry1A基因通用检测方法,检测能力覆盖了常见的16种含cry1A的转化体,开发过程包括实验室内部方法建立和实验室间循环验证。结果表明,该方法在引物终浓度0.4μmol·L^-1,退火温度64°C的条件下,能够特异性检测样品中含有的cry1A基因,检出限为0.1%。开发的cry1A基因检测方法参数全面,重复性和重现性良好,为国内外转基因成分监管与检测提供方法参考。

摘要： The degenerate primers were designed according to the mitogen-activated protein kinases Smk1 from Sclerotinia sclerotiorum. Using the degenerate primers to carry out RT-PCR, length of 856 bp cDNA fragments of mitogen-activated protein kinases Mmk1 of S. shiraiana were cloned. Sequencing results were queried for similarity against the GenBank using Blastx, and found that the amino acids sequences encoded by cloned fragments had high homology with MAPK amino acid sequences of other fungi. Real time quantitative PCR analysis revealed that expression of the gene decreased with the growth of the strain. Molecular characterization of Mmk1 will be useful for the further functional determination of the gene involving in the development of sclerotium.%根据核盘菌菌核形成相关丝裂原活化蛋白激酶Smk1的氨基酸序列设计出简并引物进行RT-PCR, 克隆获得长度为856 bp的桑椹缩小型菌核病菌丝裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段.将测序结果与GenBank数据库进行Blastx比对后, 发现克隆片段所编码的氨基酸序列与其他真菌的MAPK氨基酸序列具有较高的同源性.实时荧光定量PCR分析表明, 该基因的表达量随着菌株的生长而减少.Mmk1基因的分子克隆为进一步研究其在菌核形成中的作用奠定了基础.

摘要： 根据GenBank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法.结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL.该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、 锦鲤疱疹病毒(KHV)、 鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、 鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物.利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8.2％,Ⅱ型阳性率为85.7％,Ⅲ型阳性率为2％,Ⅰ、 Ⅱ型混合感染阳性率为4.1％,其他类型的混合感染未检测到.结果表明,本研究建立的针对Ⅰ、 Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、 省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性.

摘要： 本研究根据马铃薯Y病毒不同株系126条CP基因序列的上下游保守区设计了一对简并引物.同时利用RT-PCR技术,对不同株系的PVY样品进行了检测应用,检测结果表明,所开发的简并引物特异性强,适用于PVY各株系的检测。

摘要： LEA3基因是与高等植物抵御干旱胁迫密切相关的一类基因。根据GenBank中已登录的禾本科12个LEA3同源基因保守区设计一对简并引物，并比较了不同浓度的6种添加剂对反应结果的影响，确定8％DMSO为最优的反应体系。建立了禾本科LEA3基因快速克隆技术体系，进而利用该技术体系从高粱、茭草、竹子、甘蔗、狗牙根、药用野生稻、疣粒野生稻中成功地克隆了LEA3基因的部分片段，因此，我们推测该引物可能在禾本科LEA3基因中通用。用DNAMAN比较克隆的LEA3基因片段与大麦、小麦、水稻、玉米的同源性，其中玉米和高粱同源性高达83.9％；而玉米和狗牙根的一致性仅为44.9％。根据已克隆的片段设计特异引物，采用RACE的方法分别获得高粱1032bp和茭草1025bp的全长cDNA，并建立了高粱、茭草、大麦、小麦、水稻、玉米的系统发育树，结果表明大麦和小麦的亲缘关系较近，它们和水稻同属-个类群；高粱和玉米较近；茭草形成单独-个分枝。

摘要： 本文根据高等真菌中信息素前体羧端的CAAX模体及A交配型座位同源结构域中保守氨基酸序列,设计了176种特异性单引物,对黑木耳Auricularia auricula H2J3的F1代单核体两种交配型A1和A2的等基因池进行PCR扩增.引物XY161扩增到一条仅在A1池中出现的特异标记带XY1611462.将该特异带克隆、测序,发现其序列结构中含有内含子保守序列TACTTAC,显示该标记片段极可能位于信息素基因的下游端;利用BLAST程序搜索没有比对出同源的DNA序列,但能比对出氨基酸序列同源结构域,表明该标记片段可能编码短链脱氢酶,这与淡红侧耳Pleurotus djamor和新型隐球酵母Cryptococcus neoformans等异宗结合担子菌具有类似的结构特征.

摘要： 本发明公开了一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。本发明还公开了利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down？RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。本发明引物通用性好，检测方法快速准确。

摘要： 本发明提供用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，还提供一种利用简并引物扩增微生物醇脱氢酶基因片段的检测方法，首先提取待测样品微生物总DNA作为模板，用简并引物进行PCR扩增，纯化后进行高通量测序，通过获取测序结果是否含有醇脱氢酶和GroES‑like蛋白的操作分类单元判断待测样品微生物中是否含有醇脱氢酶。本发明从醇脱氢酶氨基酸的结构域出发，设计出用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，并应用于检测以确定醇脱氢酶基因，进而确定检测样品中含潜在产高级醇微生物种类及丰度大小，从而为样品中潜在产高级醇微生物组成的进一步研究奠定基础。

摘要： 本发明公开了一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。本发明还公开了利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-downRT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。本发明引物通用性好，检测方法快速准确。

摘要： 本发明提供了一种简并引物以及利用该引物大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因的方法，其方法是根据蛋白的保守性设计了一对通用简并引物，利于这对简并引物可快速地对各种单子叶植物中存在的具有抗农业病虫害生物活性的甘露糖结合蛋白进行基因克隆，可快速获得大量甘露糖结合蛋白新基因，极大地丰富了这类抗农业病虫害植物蛋白质基因的数量，为抗病虫害转基因农业的研究和生产提供了候选基因储备。

摘要： 本发明提供一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，涉及免疫组库测序文库的扩增制备技术领域。淋巴细胞裂解和总RNA提取：步骤一、将样本预处理后，进行RNA提取；步骤二、逆转录：对获得的淋巴细胞的总RNA进行逆转录，获得cDNA；步骤三、多重PCR：通过对cDNA进行第一轮PCR和第二轮PCR，对cDNA的TCRβ链基因进行特异性扩增；步骤四、添加测序接头序列及index，构建文库较短，但包含完整的CDR3区段，可以获得更高的通量，更低的价格，每条特异性引物的添加量与扩增体系都是经过大量实验优化后确定的，本发明可以极大降低引物二聚体的数量，获得高质量文库。

摘要： 本发明公开了一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，其序列为：PTP1‑F:5’‑NACHACHGGCCAHACRAA‑3’;PTP2‑R:5’‑GTHGAYATHATGGTMTTYAT‑3’;其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。本发明还公开了设计出的简并引物在筛选瓜氨酸降解菌方面的应用。本发明首次依据具有瓜氨酸利用能力的PTP基因设计出一对简并引物，该简并引物为具有筛选功能的通用引物，无须针对某一菌种设计特定的探针引物，方便快捷，通用性好，工作效率高，具有良好的筛选和鉴定功能；为后续探究不同菌种来源的PTP基因利用瓜氨酸能力大小的差异和受环境因素影响大小的比较提供菌种保障，为减少或消除发酵过程中生成的氨基甲酸乙酯提供了新的解决思路和方法。

摘要： 本发明公开了一种对虾白斑综合症病毒LAMP检测简并引物组、试剂盒及方法，所述简并引物组包括引物OF、OR、IF、IR、LB，其中，OF：5’‑CTTCAGACCATATKTAAGAGTG‑3’；OR：5’‑GCAGATTCCAAACCAGGAA‑3’：IF：5’‑GAGCGGGCATAGAAGTGTAAAAMAT‑TCTCTTCTTGGAATGATGAACG‑3’；IR：5’‑TCCAATATGAAGCAATGGGAGCTA‑GGTTTAAGCCATGGTCTCT‑3’；LB：5’‑GTGCTAATGGCAGCTGAA‑3’；本发明通过设计该对虾白斑综合症病毒LAMP检测简并引物组完成对虾白斑综合症病毒的特异性扩增，特异性好、灵敏度高，并在此基础上设计对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，所述LAMP检测试剂盒可在40分钟内完成多种对虾白斑综合症病毒株的检测，检测速度快，操作简便，能够广泛应用于虾白斑综合征病毒多种病毒株的快速鉴别诊断。

摘要： 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种木霉属真菌rpb2分子标记基因简并引物组及其应用。本发明公开的简并引物组，针对木霉属真菌rpb2分子标记基因的保守区域设计，可高效、精确、特异地进行扩增木霉属真菌rpb2标记基因的有效片段，极大地提高了扩增成功率和精确度，解决了针对子囊真菌设计的现有引物扩增困难，扩增产物不特异，扩增产物冗长的问题。本发明公开的PCR反应体系，模板浓度需求低，检测下限为0.032ng/μl模板DNA，检测线低，检测结果灵敏，鉴定成功率高。本发明所述的木霉属真菌菌种鉴定方法，电泳后不需纯化可直接用于测序，鉴定效率高。所述的木霉属真菌菌种鉴定试剂盒，成分简单，操作方便，适合大量样本检测，实用性好，经济及市场价值高。

摘要： 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用。本发明公开的简并引物组，针对木霉属真菌tef1分子标记基因的保守区域设计，可高效、精确、特异地进行扩增木霉属真菌tef1标记基因的有效片段，提高了扩增成功率和精确度，减少实验失败重复数，突破了依赖于tef1分子标基因记鉴定木霉属真菌的技术瓶颈。本发明公开的PCR反应体系，模板浓度需求低，检测下限为4ng/μl模板DNA，检测线低，检测结果灵敏，鉴定成功率高。本发明所述的木霉属真菌菌种鉴定方法，电泳后不需纯化可直接用于测序，鉴定效率高。所述的木霉属真菌菌种鉴定试剂盒，成分简单，操作方便，适合大量样本检测，实用性好，经济及市场价值高。

摘要： 本发明公开了用于快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的简并引物及其应用。本发明具体地公开了由引物mlrA‑354F和引物mlrA‑785R组成的简并引物对，以及快速筛选鉴定微囊藻毒素降解菌的方法。本发明通过从NCBI数据库中收集所有已公开的mlrA基因序列，利用BioEdit软件进行多序列比对，根据基因保守区设计简并引物对，以待测菌株的DNA为模板进行PCR扩增并测序，将测序结果与已知序列进行比对，结果为阳性的菌株进行MC降解能力的检测，验证PCR筛选方法的有效性。本发明得到的阳性菌株全部能够有效降解MC，表明本发明的鉴定方法具有很高的准确率，并且能有效地缩短降解菌的筛选周期，极大地节约筛选成本。