无血清培养

摘要： 人牙髓干细胞是再生医学中的主要细胞来源之一,具有多向分化潜能,已经被应用于治疗多种疾病,包括Ⅰ型糖尿病、神经系统疾病等。为满足临床需求,牙髓干细胞需进行体外扩增。常规的牙髓干细胞体外扩增方法需要运用添加胎牛血清的培养基,但近些年来由于胎牛血清存在伦理和安全两方面的问题,推荐使用无血清培养方法。本文对无血清培养基培养人牙髓干细胞的组成及方法,及其培育出的细胞的特性和其他相关应用进行综述。

摘要： 目的 建立一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的无血清培养方法.方法 用胰蛋白酶-胶原蛋白酶两步消化法分离人羊膜间充质干细胞,用含1×ITS、0.5％人血清白蛋白、10 ng/mL bFGF、100μg/mL L-ascorbic acid、100 U/mL青链霉素及2.5μg/mL两性霉素B的DMEM/F12无血清培养基进行培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态及增殖状态,免疫荧光技术检测细胞表型,WST法测定细胞增殖曲线,细胞划痕伤口闭合试验检测无血清培养的细胞迁移能力,实时定量PCR检测生长因子VEGF、KGF、PDGF和IGF-1的表达.结果 无血清培养并纯化扩增的人羊膜间充质干细胞呈梭形,表达细胞表面标志物CD73和CD90,不表达CD45和CD34.细胞增殖曲线为S形,对数增殖期的平均倍增时间为72 h,与胎牛血清培养的人羊膜间充质干细胞相比,迁移能力增强,生长因子VEGF、KGF、PDGF和IGF-1表达上调(P<0.05).结论 建立了一种人羊膜间充质干细胞的无血清培养方法,为临床应用提供实验依据.

摘要： 目的:探讨制备人间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)来源的细胞外微囊(extracellular microvesicle,MV)的适宜条件.方法:无血清条件下培养人脐带来源MSC,细胞融合达80％时,用基础培养液培养72 h后,收集培养细胞的上清,使用浓缩试剂浓缩细胞外微囊,经流式细胞术及电子显微镜鉴定,以蛋白总量为微囊含量指标.调整上清不同pH值,探测MV收获量.去营养后,收集不同培养时间的培养上清,富集微囊并测定蛋白含量,确定不同培养时间微囊产量.结果:富集的细胞外微囊表达CD9、CD63和CD81,电子显微镜下微囊呈圆形,直径在100 nm左右.使用微囊富集试剂盒收集、培养上清pH值分别为3,7和9时,每10 7个MSC收获的蛋白量分别为416.8±128.1、255.4±77.9和142.8±46.4μg,3组比较有明显差异(P＜0.05).饥饿培养48、72和96 h,每l07个MSC收获的蛋白量分别为173.6±44.5、262.4±49.6和364.2±37.8μg,3组存在显著差异(P＜0.05).结论:去营养培养96 h后收集MSC培养上清,调整pH值至3.0,可获得较多的细胞微囊.

摘要： 目的探讨改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞的效果及注意事项。方法2018年2-12月共解剖分离72只出生24 h内SD乳鼠的海马,采取Neurobasal+B27改良无血清法培养原代海马神经元细胞。铺板前使用Invitroge自动细胞计数仪计数存活及死亡细胞。细胞贴壁生长0 d、3 d、6 d、9 d、12 d时使用激光共聚焦显微镜观察神经细胞形态变化。结果平均每只乳鼠的海马可分离出(8.40±2.86)×10^(5)个神经细胞,其中存活细胞数为(5.48±1.73)×10^(5),死亡细胞数为(3.08±1.30)×10^(5),细胞总存活率为69%。细胞贴壁后第3天可观察到轴突长出,第6天树突长出,第9天和第12天可观察到周围神经细胞轴突、树突连成神经网络。贴壁后第3天胞体逐渐变大变饱满,最后呈扁圆形。细胞可存活4周左右。结论改良无血清法可用于培养原代海马神经元细胞,快速精准解剖分离及轻柔有效吹打海马组织是培养出高存活率和高活性原代海马神经元细胞的关键。

摘要： 目的 探讨改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞的效果及注意事项.方法 2018年2-12月共解剖分离72只出生24 h内SD乳鼠的海马,采取Neurobasal+B27改良无血清法培养原代海马神经元细胞.铺板前使用Invitroge自动细胞计数仪计数存活及死亡细胞.细胞贴壁生长0 d、3 d、6 d、9 d、12 d时使用激光共聚焦显微镜观察神经细胞形态变化.结果 平均每只乳鼠的海马可分离出(8.40±2.86)×105个神经细胞,其中存活细胞数为(5.48±1.73)×105,死亡细胞数为(3.08±1.30)×105,细胞总存活率为69％.细胞贴壁后第3天可观察到轴突长出,第6天树突长出,第9天和第12天可观察到周围神经细胞轴突、树突连成神经网络.贴壁后第3天胞体逐渐变大变饱满,最后呈扁圆形.细胞可存活4周左右.结论 改良无血清法可用于培养原代海马神经元细胞,快速精准解剖分离及轻柔有效吹打海马组织是培养出高存活率和高活性原代海马神经元细胞的关键.

摘要： 目的:探索骨髓胚胎样干细胞(ELSCs)的分离纯化和鉴定方法,并探讨该细胞分离培养方法的可行性.方法:采用全骨髓培养、明胶包被和无血清培养的方法,培养SD大鼠骨髓细胞,5d后进行第1次传代,以后每2d传代1次.观察其形态结构;免疫荧光检测其表面标志物CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测干性标志物SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog的表达,并与骨髓间充质干细胞(MSCs)相比较;检测其向成骨细胞和成脂细胞的诱导分化能力.结果:获得的ELSC呈现长梭形,体积小且形态均一.免疫荧光示其表达CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测示ELSCs表达CD73、CD90、CD105,且纯度高于95％,与MSCs相比,ELSCs的SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog等干性基因表达较高.结论:该方法获得的ELSCs干性较强、强度较高,可分离、培养出ELSCs.

摘要： 目的：本文试图从横纹肌肉瘤中分离出肿瘤干细胞,并对其表面的肿瘤标志物进行探究.方法：利用无血清培养的方法从儿童横纹肌肉瘤的RD细胞株中分离出具有干细胞特征的肿瘤干细胞球，并将肿瘤干细胞球进行传代，用含有血清的培养基促进其分化;将分离出的肿瘤干细胞球和普通的横纹肌肉瘤细胞按不同的浓度梯度植入96孔板中进行进行培养，MTT检测不同细胞体外的增值能力;利用裸鼠进行分离出的肿瘤干细胞致瘤性的检测;用免疫荧光的方法检测普通的横纹肌肉瘤及肿瘤干细胞球表面的干细胞标志CD133的表达情况;结果：利用含有生长因子的无血清培养基可以获得呈葡萄串状生长的横纹肌肉瘤肿瘤干细胞球，该细胞能够在含有血清的培养基中分化、贴壁生长;在MTT实验中显示分离出的该细胞较普通的横纹肌肉瘤具有更强的生存能力;该细胞较普通的肿瘤细胞具有较强的致瘤能力(P<0.5);免疫荧光实验中显示CD133在横纹肌肉瘤干细胞表面的表达明显高于普通的横纹肌肉瘤细胞。结论：可以利用无血清培养的方法从儿童横纹肌肉瘤中分离出能够自我增殖及分化的肿瘤干细胞;该细胞具有较强的增值及致瘤的能力;CD133可以作为区分横纹肌肉瘤干细胞及普通横纹肌肉瘤细胞的表面标志。

摘要： 目的：观察无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞,并比较与含10％胎牛血清培养基培养的人脐带间充质干细胞的异同.方法：采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养基或含10％胎牛血清培养.观察不同培养基培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用.结果：采用无血清MesenCult-XF培养基培养的细胞平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养基培养的细胞平均传代倍增4,59±0.45倍(P＜0.05);两种培养基培养的细胞均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异;无血清培养基培养的细胞(65±5.2)％均为Go/G1期细胞,含血清培养基培养的细胞(62±3.1)％为Go/G1期细胞(P＞0.05);两种培养基培养的人脐带间充质干细胞均可向成脂、成骨分化;无血清培养的脐带MSC按1000、5000、10000、20000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的CPM值分别为(6.43±0.47)×104、(4.30±-0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104.结论：该研究中无血清培养的细胞均为间充质干细胞,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏.

摘要： 本研究以猪的脂肪干细胞(ADSCs)为源头细胞开展重编程，并建立无饲养层、无血清培养猪iPSCs诱导获取体系，从源头细胞类型上进一步优化猪的体细胞重编程方案，以获得安全、可靠的iPSCs系，为今后进行iPSCs克隆猪生产，丰富转基因猪创制手段，或服务于人类iPSCs的安全性和有效性评价等奠定基础。

摘要： 本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(29SF)，经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力;平均病变时间为97.00 h，比HEK293细胞缩短12.9％;毒价达到107.48TCIDmL，比HEK293细胞提高43.3％;并且随着代数的提高稳定性良好，连续传16代后293sF细胞状态与易感性没有发生变化。此细胞系为腺病毒的无血清生产奠定材料基础。

摘要： 目的：对WuT3杂交瘤细胞无血清生物反应器培养上清中单克隆抗体进行分离纯化，建立中试分离纯化工艺。rn 方法：采用二步离子交换层析法结合硫酸铵盐析法分离纯化wul3单抗。在通过小量试验优化纯化参数后，进行中量放大和中试放大。rn 结果: 建立的纯化方法可以放大到中试规模，每批投料30000ml培养上清可收获单抗达1.5g，单抗总回收率＞60％。经分离纯化后，单抗IgG纯度＞95％，采用免疫荧光法检测抗体活性合格。rn 结论: 建立了一条生物反应器无血清培养杂交瘤细胞收获上清的大规模分离纯化工艺路线。

摘要： 本文开发了一种适合HEK.293细胞高密度生长的无氨低乳酸的廉价无血清培养基(HEK 293 SFMC).在该无血清培养基中培养HEK.293细胞,培养第5天时,最大细胞密度可达到3.8×106 cells/ml.

摘要： 为了实现PK15细胞的无血清培养,试验采用逐步降低培养液中血清量的方法对PK15细胞进行无血清培养驯化,并在驯化成功的PK15细胞上培养PCV2(猪圆环病毒2型).结果表明,血清浓度在0.1％时的细胞可正常生长并且对PCV2的增殖性能和病毒滴度没有改变.

摘要： 目的:在体外以缺氧无血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡，探讨丹酚酸B抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs凋亡作用。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs，用分别含0.1、1、10、100mg几丹酚酸B的完全培养液预处理1h后用磷酸盐缓冲液冲洗2次，再加入含0.1、1、10、100mg/L丹酚酸B的不含血清培养液，共4组，然后与凋亡模型组一起缺氧培养6h，正常对照组常规培养6h，采用Hoechst染色及倒置相差、荧光显微镜观察和Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。结果缺氧无血清能够引起大鼠BMSCs明显凋亡，0.1、1、10mg/L、100mg/L丹酚酸B处理组大鼠BMSCs早期凋亡率较模型组显著降低(P<0.01);而中晚期凋亡率和凋亡模型组比较无统计学差异。结论:0.1、1、lOmg/L、100mg/L丹酚酸B能够抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs早期凋亡，从而提高移植干细胞的存活率。

摘要： 目的:在体外以缺氧无血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡，探讨丹酚酸B抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs凋亡作用。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs，用分别含0.1、1、10、100mg几丹酚酸B的完全培养液预处理1h后用磷酸盐缓冲液冲洗2次，再加入含0.1、1、10、100mg/L丹酚酸B的不含血清培养液，共4组，然后与凋亡模型组一起缺氧培养6h，正常对照组常规培养6h，采用Hoechst染色及倒置相差、荧光显微镜观察和Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。结果缺氧无血清能够引起大鼠BMSCs明显凋亡，0.1、1、10mg/L、100mg/L丹酚酸B处理组大鼠BMSCs早期凋亡率较模型组显著降低(P<0.01);而中晚期凋亡率和凋亡模型组比较无统计学差异。结论:0.1、1、lOmg/L、100mg/L丹酚酸B能够抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs早期凋亡，从而提高移植干细胞的存活率。

摘要： 目的:在体外以缺氧无血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡，探讨丹酚酸B抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs凋亡作用。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs，用分别含0.1、1、10、100mg几丹酚酸B的完全培养液预处理1h后用磷酸盐缓冲液冲洗2次，再加入含0.1、1、10、100mg/L丹酚酸B的不含血清培养液，共4组，然后与凋亡模型组一起缺氧培养6h，正常对照组常规培养6h，采用Hoechst染色及倒置相差、荧光显微镜观察和Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。结果缺氧无血清能够引起大鼠BMSCs明显凋亡，0.1、1、10mg/L、100mg/L丹酚酸B处理组大鼠BMSCs早期凋亡率较模型组显著降低(P<0.01);而中晚期凋亡率和凋亡模型组比较无统计学差异。结论:0.1、1、lOmg/L、100mg/L丹酚酸B能够抗缺氧无血清诱导的大鼠BMSCs早期凋亡，从而提高移植干细胞的存活率。

摘要： 本发明涉及一种无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，由重组人胰岛素样生长因子一1：0.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子一B：0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子：0.05～0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.04～0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)∶0.001～0.05％(w/v)，巯基乙醇：0.3～0.5mol/L组成；添加到RPMI1640或DMEM等培养基中，能使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等快速贴壁，旺盛地生长；6～12小时换液一次，基础培养基添加该配方成分所培养出的细胞密度可达到与有10％血清培养基相媲美的一致使用效果，完全可以替代血清添加到基础培养基中用于CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等的培养。

摘要： 一种人成纤维细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5‑100ng/mL，葡多酚为50‑200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子‑C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子‑1浓度为1～10ng/mL，β‑巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1‑100μg/mL，黄芪多糖为1‑50μg/mL，透明质酸0.1‑5μg/mL，碳酸氢钠为1.0‑3.7g/L。利用无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人成纤维细胞，避免了动物源性成分污染以及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

摘要： 【解决课题】本发明提供一种人软骨细胞的无血清培养方法、无血清培养基。【解决方案】本发明提供一种软骨细胞的无血清培养方法，包括：用蛋白分解酶处理含人软骨细胞的组织的酶处理工序；在酶处理工序之后，用前述蛋白分解酶的抑制剂处理前述组织的抑制剂处理工序；以及在抑制剂处理工序之后，用含有卡托吉宁Kartogenin或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松的无血清培养基培养前述组织的培养工序。本发明提供一种用于培养软骨细胞的无血清培养基，含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。

摘要： 本发明公开的人脐带间充质干细胞无血清培养基、制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液的获取方法，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物5‑100ng/ml，葡多酚50‑200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子‑C 1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子‑1 1～10ng/ml，β‑巯基乙醇50～200μM，人血白蛋白1～100μg/ml，谷胱甘肽1‑100μg/ml，碳酸氢钠1.2‑3.7g/L。利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

摘要： 本发明涉及适用于免疫疗法的自然杀伤细胞培养技术，更具体而言，涉及与现有的免疫细胞培养方法相比，即便是采血后经过1天以上或极为衰弱的免疫细胞，也能够实现有效率的扩增以及激活的同时，显著增加NK细胞所占比率进行培养的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、利用该试剂盒的免疫细胞培养方法、通过该试剂盒或培养方法获得的免疫细胞无血清培养液以及包含该培养液的化妆材料组合物。

摘要： 本发明公开适合用于培养人造血干细胞的无白蛋白的无血清培养基的组成和无白蛋白的培养方法。根据本发明，提供培养人造血干细胞的方法，该方法包括使人造血干细胞与PVA和PI3K激活剂接触的步骤。

摘要： 【解决课题】本发明提供一种人软骨细胞的无血清培养方法、无血清培养基。【解决方案】本发明提供一种软骨细胞的无血清培养方法，包括：用蛋白分解酶处理含人软骨细胞的组织的酶处理工序；在酶处理工序之后，用前述蛋白分解酶的抑制剂处理前述组织的抑制剂处理工序；以及在抑制剂处理工序之后，用含有卡托吉宁Kartogenin或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松的无血清培养基培养前述组织的培养工序。本发明提供一种用于培养软骨细胞的无血清培养基，含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。

摘要： 一种人成纤维细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5‑100ng/mL，葡多酚为50‑200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子‑C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子‑1浓度为1～10ng/mL，β‑巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1‑100μg/mL，黄芪多糖为1‑50μg/mL，透明质酸0.1‑5μg/mL，碳酸氢钠为1.0‑3.7g/L。利用无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人成纤维细胞，避免了动物源性成分污染以及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

摘要： 本发明公开了一种用于VERO无血清细胞培养及相应病毒生产的无血清培养基，包括以下组成成分：氨基酸、维生素、无机盐类、辅助成分和蛋白质类，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、盐酸精氨酸、二盐酸胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、一水盐酸组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸二钠盐二水合物、缬氨酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、牛磺酸；所述蛋白质包括人转铁蛋白、重组胰岛素；本发明制备的培养基在用于VERO细胞培养时，不依赖动物血清的使用，且没有引用动物源蛋白，极大地降低了生产成本，并充分保证产品质量稳定，可实现长时间培养和传代而不增加细胞凋亡比例。

摘要： 本发明公开的人脐带间充质干细胞无血清培养基、制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液的获取方法，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物5‑100ng/ml，葡多酚50‑200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子‑C 1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子‑11～10ng/ml，β‑巯基乙醇50～200μM，人血白蛋白1～100μg/ml，谷胱甘肽1‑100μg/ml，碳酸氢钠1.2‑3.7g/L。利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。