自杀基因治疗

摘要： 2021年7月13日,《治疗诊断学》(加ewnosMe)在线发表了浙江大学药学院高建青教授团队的最新研究成果"Iron oxide nanoparticles promote Cx43-overexpression of mesenchymal stem cells for efficient suicide gene therapy during glioma treatment"(https://doi.org/10.7150/thno.60160).

摘要： Suicide gene therapy is an important method of gene therapy for cancer.It has been successfully used in a large number of in vitro and in vivo studies.The two major suicide gene therapeutic strategies currently pursued are:herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir(HSV-tk/GCV)and cytosine deaminase/5 -fluorocytosine(CD/5-FC).In this review,we summarize the different suicide gene systems and gene delivery vectors addressed to canc-er,and the different strategies that have been used with suicide gene therapy and provide some insights into the future directions of this approach,particularly towards nanoparticle carrier and cancer stem cells.%自杀基因靶向疗法在恶性肿瘤的治疗方法中占有重要的位置。众多体内体外试验已经证明了自杀基因的肿瘤杀伤效应。目前，相关的临床试验也证实HSV-tk/GCV，CD/5-FC等自杀基因系统具有良好的抗肿瘤效应。然而在临床推广应用上还有很多问题需要解决，如基因靶向转移困难、基因转染效率较低、基因转移后的表达缺乏有效的调控手段和基因杀伤效应较低且难以控制等，这些问题均有待于我们在今后的研究中进一步解决。本文将从自杀基因的种类、载体、作用机制、旁观者效应和临床发展前景，尤其是纳米粒载体和肿瘤干细胞理论的应用等方面进行综述。

摘要： 目的:总结鼻咽癌基因治疗研究进展,为临床治疗及基础研究提供参考.方法:在万方、中国知网、pubmed数据库检索近年关于鼻咽癌基因治疗的研究资料,并进行综合分析.结果:鼻咽癌基因治疗在基础研究方面取得满意的效果,在临床应用中副作用少、医从性好.具体方法有免疫基因治疗,自杀基因治疗,基因替代治疗,基因沉默治疗和反义基因治疗.结论:基因治疗将成为鼻咽癌治疗的重要手段.

摘要： Thymidine kinase gene was expressed in Lactococcus lactis by the nisin controlled gene expression system. Thymidine kinase was obtained by gene cloning and expressing, and the expressed products were identified by SDS-PAGE. The vector pNZ8148-HSV1-TK constructed in Lactococcus lactis NZ9000 was sequenced and blasted in NCBI, and the result showed that the sequencing of pNZ8148-HSV,-TK had 99% similarity with that of Accession No. EU530625.1 (Cloning vector pWSTK6). In addition, a 41KD protein with the same size of TK protein secreted by Lactococcus lactis NZ9000 was gained through SDS-PAGE, which provided an evidence that the vector construction had been done. Thymidine kinase was able to be expressed steadily by the vector pNZ8148-HSV1-TK constructed in Lactococcus lactis NZ9000.%利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相似度99％；同时,通过SDS-PAGE观察到乳酸乳球菌NZ9000表达的TK酶.成功构建的重组质粒pNZ8148-HSV,-TK能够在乳酸乳球菌NZ9000中稳定表达TK酶.

摘要： 目的:研究重组腺相关性病毒( rAAV)介导的含有Tet-On调控元件的HSV-TK/GCV自杀基因调控治疗系统对人类乳腺癌细胞株MCF-7 DNA损伤的影响及损伤应答的分子机制.方法:彗星实验检测HSV-TK/G CV自杀基因治疗系统对MCF-7 DNA损伤的影响,并对主要的DNA损伤应答的相关活性基因和表达蛋白进行RT-PCR和Western印迹检测,分析其表达变化情况.结果:与各对照组相比,实验组MCF-7细胞的彗星实验结果有明显的彗星拖尾现象,DNA损伤应答的相关活性基因和活性蛋白(如ATM,p53和p27)的表达水平产生了明显的差异,而CyclinE和CDK2的表达水平没有明显变化.结论:HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统可以导致MCF-7的DNA损伤反应,这种损伤反应可能是通过一种p53依赖的信号通路引起细胞阻滞导致死亡.%Objective To determine the effect and molecular mechanism of DNA damage caused by suicide gene therapy system HSV-TK/GCV under Tet-On regulation in human breast cancer cell line MCF-7 infected by recombinant adeno-associated virus ( rAAV ). Methods We used comet assay to detect the effect of HSV-TK/GCV suicide gene regulation system on MCF-7 DNA damage, and analyzed the expression change of relative DNA damage response active genes and proteins with RT-PCR and Western blot. Results Compared with other control groups, the comet assay showed that MCF-7 cells with HSV-TK/GCV treatment had obvious comet tails, and the expression level of DNA damage response active genes and proteins changed obviously in the HSV-TK/GCV treatment group, such as ATM, p53 and p27, but CyclinE and CDK2 did not change. Conclusion DNA damage on MCF-7 cells is resulted from HSV-TK/GCV in suicide gene therapy system through a p53-dependent signal pathway, causing cell cycle arrest and cell death.

摘要： Objective: To evaluate the killing effect of lentivirus mediated CD/TK fusion gene controlled by kinase insert domain-containing receptor (KDR) promoter on human breast cancer cells in vivo.Methods: Nude mice were used as hosts for cell line MCF-7 xenografts to establish the animal model of breast cancer.The tumor-bearing mice were randomly divided into 4 groups.Group Ⅰ were blank controls with tumor-bearing mice with no treatment.Group Ⅱ was injected with lentivirus and prodrug ( 5-FC+ GCV ).Group Ⅲ was injected with lentivirus.Group Ⅳ was injected with prodrug.Tumor growth rate, tumor size and weight were observed.The expression of double suicide genes in xenograft tumors was examined by RT-PCR.The tumor tissue was analyzed by hematoxylin-eosin staining and PCNA immunohistochemistry.Flow cytometry (FCM) was used for cell cycle analysis.Results: Tumor growth was obviously inhibited in group Ⅱ.But there was no significant difference in tumor growth among group Ⅰ, group Ⅲ, and group Ⅳ.RT-PCR demonstrated the existence of CD/TK gene in genetically modified xenograft tumor cells.The expression of PCNA was lower in tumor tissue of group Ⅱ than in group Ⅰ.Flow cytometry analysis showed that the proportion of G1 phase cells was increased and the proportion of G2-M phase cells was decreased.Conclusion: Combined with the prodrug, FGW-KDRP-CD/TK can significantly inhibit the growth of implanted breast cancer cells in nude mice and cell cycle arrest, which may be related to its inhibitory effect on PCNA expression.%目的:研究慢病毒介导的KDR启动子驱动的胞嘧啶脱氨酶(CD)/胸苷激酶(TK)融合基因系统(FGW-KDRP-CD/TK)对乳腺癌细胞的体内杀伤作用.方法:培养乳腺癌MCF-7细胞,建立裸鼠荷瘤模型.荷瘤后将裸鼠随机分为4组.Ⅰ组:空白对照,荷瘤但不施加任何处理;Ⅱ组:注射慢病毒与前药(5-FC+GCV);Ⅲ组:仅注射慢病毒;Ⅳ组:仅注射前药.观察肿瘤生长速度,测量瘤体大小及重量;用RT-PCR法鉴定双自杀基因在转基因瘤组织中的表达;取肿瘤组织进行HE及PCNA免疫组化染色;流式细胞技术进行细胞周期检测.结果:第Ⅱ组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制,第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况无明显差异.经RT-PCR检测发现转基因瘤组织有目的基因的表达.与第Ⅰ组(空白对照组)相比,第Ⅱ组瘤组织的PCNA表达明显下调.流式细胞仪检测细胞周期分析显示治疗后G1期细胞比率增多,G2/M期细胞减少.结论:FGW-KDRP-CD/TK联合前药5-FC及GCV在体内可明显抑制移植瘤的生长,细胞周期阻滞,该作用可能与抑制PCNA表达有关.

摘要： 目的 利用AdEasy系统构建低氧射线双调控的TK表达载体--腺病毒Ad.HRE.CArG.HSV-TK,并观察其对人乳腺癌细胞系Bcap37和MDA-MB-435的放射增敏作用.方法 用分子克隆技术构建插入HRE.CArG.HSV-TK片段的Ad.HRE.CArG.HSV-TK.CsCl梯度离心法纯化病毒,用AdEasy系统GFP标签测定病毒功能滴度.Ad.HRE.CArG.HSV-TK体外转导细胞48h,流式细胞仪测GFP阳性率,Real-time RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测腺病毒(Ad)转导联合放射(RT)对细胞的生长抑制作用和放射增敏比(SER).结果 Ad.HRE.CArG.HSV-TK滴度为2.1×109TU/mL.50 MOI病毒转导Bcap37和MDA-MB-435细胞48 h,GFP阳性率分别为92%和93%,TK基因表达明显增加(P<0.05).Ad与RT联用组(Ad+RT)细胞生长抑制率明显高于Ad组和相应同等剂量RT组(P<0.05),SER为1.55.结论 应用AdEasy系统可制备同时表达GFP和TX的重组腺病毒.腺病毒对乳腺癌细胞具放射增敏作用,为进一步开展乳腺癌的基因放射治疗奠定基础.

摘要： 目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用.rn方法:将双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞株.通过RT-PCR和 Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况.用HPLC法测定转染Y79细胞中5-FC向5-FU的转化效率.向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5-FC(0,25,50,100,200,400,800mg/L)和/或GCV(0,2,4,8,16,32,64mg/L),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率.rn结果:双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞成功:在载体转染的Y79细胞中,RT-PCR扩增出长度为403bp的特异条带,Western blot检测见一59kD大小的条带,与CDTK基因序列分析的预期结果一致.双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低:转染Y79细胞中,5-FC向5-FU转化的效率为84.5%.转染和未转染Y79细胞中加入5-FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低,两组比较当5-FC浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0.05).转染组间比较,当5-FC达200mg/L,GCV达16mg/L后,5-FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5-FC或GCV组,有统计学差异(P<0.05).rn结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK转染Y79细胞后,在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白.给予5-FC和GCV达到一定浓度时,它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用.双前体药物的杀伤作用大于单前体药物.

摘要： 目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体系统pc-ChCDTK对视网膜母细胞瘤的体内杀伤作用.方法:用G418筛选载体阳性转染的Y79细胞;通过皮下注射载体转染和未转染的Y79细胞致瘤BALB/C小鼠,每组10只.Y79细胞皮下移植术7d后,向成瘤裸小鼠腹腔注射前体药物5-Fc+GCV(5-Fc 500mg/kg +GCV 30mg/kg),连续给药15d,每天测量1次皮下移植瘤长径和短径,计算体积.末次给药后3d处死裸小鼠,取皮下移植瘤组织做HE染色,并提取组织RNA,用RT-PCR检测CDTK的表达.结果:未转染组裸小鼠8只成瘤,转染组裸小鼠7只成瘤.两组比较,转染组皮下移植瘤的体积较未转染组小,有统计学差异(P＜0.05);转染组瘤组织HE染色中可见散在坏死组织.转染组皮下移植瘤组织中检测到403bp片段,与CDTK预期mRNA大小一致.结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK系统对裸小鼠的视网膜母细胞瘤皮下移植瘤的生长有抑制作用.

摘要： 目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901靶向杀伤作用以及是否存在旁观者效应.方法 用MOI=100时,将携带融合基因重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK体外感染SCG7901、ECV304和HepG2细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦分别按不同浓度、不同作用时间和方式下,观察双自杀基因体系对SCG7901细胞的靶向杀伤作用和旁观者效应.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901、HepG2和ECV304细胞中有GFP表达.感染腺病毒Ad-CMV-CDglyTK的各细胞以及感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞对单一前药具有较高的敏感性,细胞的存活率各随单一前药浓度的增加而递减;而感染腺病毒的Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞对前药不敏感.感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞分别在同一浓度前药的作用下,细胞的存活率与时间存在依赖关系,而感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞不存在依赖关系.将感染腺病毒的细胞与未感染的细胞按不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应,并随转基因细胞的比例增加逐渐递增.转基因SCG7901和同种细胞混合,在联合应用前药时,不同混合细胞比例下均出现药物协同作用.结论 Ad-KDR-CDglyTK双自杀基因可在体外靶向杀伤SCG7901、ECV304细胞并观察到在细胞中存在旁观者效应,联合应用前药可产生明显的协同作用.

摘要： 本发明公开了一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时以更高敏感度监控目的蛋白质的血液中浓度，并且标记肽不具有生理作用而在多种动物中无免疫原性。基因治疗用载体具有如下结构：在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。

摘要： 本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防由RPE65基因突变引起的2型Leber先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA2)。本发明的基因治疗载体包含人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)、启动子及增加基因表达的血管紧张素II型受体内含子1。本发明还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合物。

摘要： 本发明涉及一种基因治疗载体，包含显性抑制型(dominant negative)人类sterile apha and TIR motif‑containing 1(dnSARM1)、启动子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合。其优点表现在：本发明的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼引起的视网膜神经节细胞病变。

摘要： 本发明涉及一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物，所述基因载体包含显性抑制型(dominant negative)人类Fas‑associatedprotein with death domain(FADD‑DN)、增强子/启动子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明还涉及上述基因载体或包含上述基因载体的组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。其优点表现在：本发明的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼等引起的视网膜神经节细胞病变。

摘要： 本发明提供一种使用表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)的细胞介导的癌症基因治疗。向有肿瘤的个体施予该MSC，让该MSC迁移到肿瘤部位，并且接着向所述个体施用前药。该MSC在肿瘤部位对自杀基因的表达将所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。肿瘤对该个体健康的影响因而能够减轻或者消除。本发明的MSC通过使用永生化的MSC系以及筛选具有免疫学特性的MSC以防止移植物抗宿主反应，可最优化为即用型产品。

摘要： 本发明公开了一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时以更高敏感度监控目的蛋白质的血液中浓度，并且标记肽不具有生理作用而在多种动物中无免疫原性。基因治疗用载体具有如下结构：在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19－29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。

摘要： 本发明涉及一种基因治疗载体，包含显性抑制型(dominant negative)人类sterile apha and TIR motif‑containing 1(dnSARM1)、启动子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合。其优点表现在：本发明的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼引起的视网膜神经节细胞病变。

摘要： 本发明涉及一种表达p65的基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物，所述的基因载体包含激活型的(constitutively active)人类p65(p65(CA))、启动子/增强子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明还涉及上述基因载体或包含上述基因载体的组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。其优点表现在：本发明的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼等引起的视网膜神经节细胞病变。

摘要： 本发明提供一种基于氨基化二氧化硅纳米颗粒-CD/TK融合基因复合物的肝癌自杀基因治疗药物，其制备方法步骤为：1)通过PCR扩增CD、TK基因并建成融合基因，并克隆到常规质粒载体中，在载体中由人源端粒酶启动子启动融合基因的表达，并采用CMV增强子来增强融合基因的转录；2)将构建好的质粒与氨基化二氧化硅纳米颗粒混合，形成稳定的纳米-DNA复合物；3)作为基因治疗药物用于肝癌的治疗，药物在体内或体外可转染肝癌细胞，CD/TK能在肝癌细胞中高表达，并能将前体药物5-Fc转化成毒性药物5-Fu，对肝癌细胞有明显毒性和杀伤作用。

摘要： 本发明提供一种基于氨基化二氧化硅纳米颗粒-CD/TK融合基因复合物的肝癌自杀基因治疗药物，其制备方法步骤为：1)通过PCR扩增CD、TK基因并建成融合基因，并克隆到常规质粒载体中，在载体中由人源端粒酶启动子启动融合基因的表达，并采用CMV增强子来增强融合基因的转录；2)将构建好的质粒与氨基化二氧化硅纳米颗粒混合，形成稳定的纳米-DNA复合物；3)作为基因治疗药物用于肝癌的治疗，药物在体内或体外可转染肝癌细胞，CD/TK能在肝癌细胞中高表达，并能将前体药物5-Fc转化成毒性药物5-Fu，对肝癌细胞有明显毒性和杀伤作用。