基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定量的方法

摘要

本发明公开了一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时以更高敏感度监控目的蛋白质的血液中浓度，并且标记肽不具有生理作用而在多种动物中无免疫原性。基因治疗用载体具有如下结构：在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19－29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。

说明书

技术领域

本发明涉及可以对在生物体内或培养细胞内生产的目的蛋白质进行简便定量的，用于在生物体内生产目的蛋白质的基因治疗用载体。

背景技术

在患者体内生产目的蛋白质进行基因治疗时，目的蛋白质的血浓度只有在可以建立该蛋白质的ELISA法等测定方法时可以进行确定，在不能建立上述测定方法时不能进行确定。利用标记蛋白测定上述蛋白浓度的分析方法已实际应用并作为商品销售。但是，这种测定的灵敏度低，尚没有建立用于在基因治疗测定血液浓度的方法。参考文献(Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding IFN-γR/Fc，TheJournal of Clinical Investigation，2000年7月，第106卷，第2期，p207-215)中通过不测定目的蛋白质而对受其影响的蛋白质定量化间接地证明了目的蛋白质的表达。显示出血液中浓度测定的难度。

发明的公开

本发明的目的在于提供一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时高敏感度地监控目的蛋白质的血液中浓度，几乎不会引起由标记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反应。

本申请的发明人进行深入的研究结果发现，通过以整合了编码由通过基因治疗有待在体内生产的目的蛋白质和胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽的融合蛋白质的核酸的载体进行基因治疗，以上述胰高血糖素肽为标记可高敏感度地测定目的蛋白质的血液中浓度，并且发现几乎不会诱导由标记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反应，从而完成本发明。

换言之，本发明提供了一种基因治疗用载体，该载体具有如下结构：在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸，其能够在哺乳动物细胞内生产前述融合蛋白质。此外，本发明提供了一种基因治疗方法，其包括将有效量的上述本发明的基因治疗用载体施用于有待上述目的蛋白质在体内或细胞内表达的哺乳动物或培养哺乳动物细胞。进而，本发明还提供了上述本发明的基因治疗用载体在制备基因治疗用药物中的用途。进而，本发明还提供了，通过前述基因治疗用载体的表达对体内或培养哺乳动物细胞内生产的目的蛋白质的定量方法，其包括对从施用了上述本发明的基因治疗用载体的哺乳动物或培养哺乳动物细胞中收集的被检试样中的C末端侧19-29个氨基酸肽区域进行免疫测定。进而，本发明还提供了在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞中由外部施用的表达载体的表达所生产的目的蛋白质的标记剂，其包含胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸的肽。进而，本发明还提供了一种体内或培养细胞内生产的蛋白质的标记方法，其包括通过以与作为标记剂的胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽的融合蛋白质形式表达由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质，从而在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内以胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽对体内或培养细胞内生产的目的肽进行标记。进而，本发明还提供了胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽作为在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质的标记剂的用途。

通过本发明，首次提供了下述基因治疗用载体，其能够以高敏感度测定目的蛋白质的血液中浓度且其标记肽不具有生理作用。胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽由于其没有自体生理作用，在各种哺乳动物中十分保守，且基本不引起免疫反应，因此通过采用市售的免疫测定试剂盒的高敏感度地免疫测定可对其定量。

附图的简要说明

图1表示实施例1中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列。

图2是图1的续。

图3是图2的续。

图4表示实施例1-5中使用的用于哺乳动物表达的载体pCAGGS的基因图谱。

图5表示实施例1中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。

图6表示实施例1中测定的，在采用本发明的载体进行基因治疗时的目的蛋白质的血液中浓度，以及采用本发明的载体进行基因治疗时和采用插入了编码没有融合来自胰高血糖素的标记肽的目的蛋白质的核酸的载体进行基因治疗时的血糖值随时间的变化。

图7表示实施例2中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。

图8是图7的续。

图9是图8的续。

图10表示实施例2中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。

图11表示实施例2和比较例2中，大鼠的移植心脏的附着生长天数。

图12表示实施例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。

图13是图12的续。

图14是图13的续。

图15表示比较例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。

图16是图15的续。

图17表示实施例3中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。

图18表示实施例3和比较例3中，大鼠的心肌炎病变部位的面积比率。

图19表示实施例4中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。

图20是图19的续。

图21是图20的续。

图22表示实施例4中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。

图23表示实施例4和比较例4中，大鼠的心肌炎病变部位的面积比率。

图24表示实施例5中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。

图25表示实施例5中用于通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度，与通过人白介素8测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的相互关系。

发明的最佳实施方式

通过本发明的载体与目的蛋白质融合表达的所谓“胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽”是指从胰高血糖素的C末端算起从第19位至第29位的合计11个氨基酸构成的肽。即，该肽具有序列表的序列号1所示的氨基酸序列的肽。这个“胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽”作为目的蛋白质的标记使用，下面，方便起见称为“来自胰高血糖素的标记肽”。

本发明的载体中整合了编码来自胰高血糖素的标记肽区域与目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。

本发明中使用的用于哺乳类动物的表达载体是基因治疗领域公知的，其没有限制只要是用于哺乳类动物的表达载体即可。本发明的特征在于作为目的蛋白质的标记的来自胰高血糖素的肽的区域与目的蛋白质相融合的形式表达，用于哺乳类细胞的表达载体没有任何限定，可以使用在基因治疗领域中使用的公知的任一用于哺乳类细胞的表达载体。可以是质粒载体也可以是病毒载体，从安全性角度考虑，优选使用质粒载体。各种用于哺乳类细胞的表达载体是众所周知的，此外也有市售的，可以优选使用这些周知的或市售的载体。周知或市售的载体的例子可列举为pCAGGS(Efficient selection for high expressiontransfactans with a novel eukaryotic vector，Gene 1991Dec.15，108(2)p193-199，基因图谱示于图4，其碱基序列示于序列表的序列号3)、PROMEGA公司的pCI载体、pSI载体和pTARGET载体以及INVITROGEN公司的pcDNA5/TO等，其不受上述限定。

通过基因治疗于体内生产的目的蛋白质没有任何限定，可举例为如干扰素、白介素和CTLA4之类的各种细胞因子、生长因子、胰岛素等激素和细胞粘着因子等及其受体。此外，任意的抗原蛋白质可通过基因疫苗形式在体内得以生产。此外，目的蛋白质本身也可以是融合蛋白质。例如，也可以在需要与Fc受体结合的所需的细胞因子的一端融合免疫球蛋白，优选IgG，尤其是IgG1的恒定区域(Fc)，以提高与Fc受体的结合能力的目的蛋白质(参照下述实施例1-4)。编码IgG的Fc区域的核酸的碱基序列是周知的，例如编码人的IgG的Fc区域的核酸的碱基序列记载于例如Genebank登录号：BC020823等处，编码大鼠的IgG的Fc区域的核酸的碱基序列示于本申请的图1-3等中。

本发明的载体通过在哺乳动物细胞用表达载体的克隆位点处插入编码目的蛋白质与上述标记肽的融合蛋白质的核酸获得。并且，标记肽优选融合于目的蛋白质的一端尤其是C末端。

基因治疗可通过将本发明的基因治疗用载体施用于哺乳动物来进行。施用途径优选静脉注射或肌肉注射之类的非经口腔施用途径。载体的施用量可根据目的蛋白质的性质、有待治疗的疾病的种类和程度等进行相应设定，每1kg体重的载体施用量通常是1mg-10mg左右，优选2mg-4mg左右。作为制剂，可以使用例如溶解于林格氏(ringer)溶液中的基因治疗用载体溶液作为注射液。可以在其中添加医药制剂领域中周知的注射用添加剂。或者，也可以将本发明的基因治疗用载体施用于体外培养的哺乳动物细胞。即，将淋巴细胞或骨髓细胞等细胞取出进行体外培养，对培养细胞施以基因载体，再以获得具有目的蛋白质生产能力的细胞对患者进行的基因治疗，本发明的基因治疗用载体也可施用于培养哺乳动物细胞。或者，可在体外研究基因治疗用载体的治疗效果的实验中施用培养的哺乳动物细胞。

在基因治疗中，通过向体内导入的载体生产上述目的蛋白质与来自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。另外，对体外培养的哺乳动物细胞施用基因治疗用载体时，该培养细胞内生产出上述目的蛋白质与来自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。由于目的蛋白质与标记肽融合，可以通过测定来自胰高血糖素的标记肽的浓度来测定目的蛋白质的浓度。并且，由于免疫测定本发明中使用的来自胰高血糖素的标记肽的试剂盒是市售的(DAICHI RADIOISOTOPELABORATORIES，公司等制备的胰高血糖素RIA试剂盒)，可以使用这种市售免疫测定试剂盒容易地进行测定。

定量来自胰高血糖素的标记肽的被检试样是来自施用了本发明的基因治疗用载体的个体的各种体液或组织等或其稀释物，优选是全血，血清或血浆或其稀释物等血液试样。此外是，基因治疗用载体施用于体外培养的哺乳动物的情况下，被检试样是培养细胞的匀浆或培养上清液等。

实施例1、比较例1

以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-tcaaccactgcacaaaatcttgggctttacccggagagtgggagagact-3’作为引物进行PCR，进而用以该PCR产物的300倍稀释物为模板，用5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用EcoR I将扩增产物整合入用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的克隆位点。通过这些步骤，获得插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的pCAGGS-IgG-glu19-29(在免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的编码区域的下游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段插入pCAGGS的EcoR I部位)。

下面，以大鼠心肌炎的心脏的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatgattctgctggtggtcctgatg-3’，5’-gcagcatcgcggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和NotI将PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。

通过这些步骤，在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有序列表的序列号2所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的DNA片段，制备出本发明的载体(实施例1)。并且，图1-图3还显示了序列号2的其它信息。如图1至图3所示，插入的核酸片段为，在两端都有EcoR I位点的，且位于编码干扰素γ受体(IFNγR)蛋白质与免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的融合蛋白质的区域的下游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段(IFNγR-IgG-胰高血糖素^19-29)。

对7只大鼠每一只的尾静脉注射不含来自胰高血糖素的标记肽的质粒载体(比较例1)和以上述方式制备的含有来自胰高血糖素的标记肽的本发明的质粒载体(实施例1)，进行基因治疗。注射液的组成是在20ml的林格氏溶液中溶解了800μg的质粒每只。注射后，随时间推移采血，将采血获得的1-10μl的血浆稀释100-1000倍，用市售的RIA试剂盒，按照该试剂盒附带的说明书测定来自胰高血糖素的标记肽的浓度，进而测定目的蛋白质(本实施例中是IFNγR/IgG1Fc融合蛋白质)的浓度。即，RIA具体是按以下方式进行。在400μl检测用缓冲液中添加200μl标准胰高血糖素溶液或稀释的被检血浆，进而添加100μl胰高血糖素-¹²⁵I溶液，添加100μl胰高血糖素抗血清，4℃下放置48小时。之后，添加100μl第二抗体，400μl胰高血糖素RIA用沉淀稳定剂，4℃下放置30分钟，离心分离(2000×g30分钟，4℃)后，除去上清液后测定计数率求出浓度。

图5是血液中浓度的测定结果。实施例1中，静脉注射后第1天结果为2870±1062ng/ml(平均±标准偏差)，第3天为1440±334ng/ml，第7天为1120±433ng/ml，第16天为281±162ng/ml，所有的例子均可被测定。另一方面，用不含来自胰高血糖素的标记肽的质粒载体的基因治疗中，以同样方式检测，其结果低于检测限。

图6是质粒静脉注射4，8，12小时后的血糖值和以上述同样方式用RIA测定法检测的蛋白血液中浓度的值。实施例1中，血糖浓度4小时后显示为2815±2318ng/ml，8小时后为6061±2789ng/ml，12小时后为5752±2270ng/ml，显示出最大血液中浓度的8-12小时后的血糖为8小时后89.3±15.1mg/dl(实施例1)vs 81.8±7.5mg/dl(比较例1)，12小时后63.5±5.7mg/dl(实施例1)vs 71.4±6.9mg/dl(比较例1)，没有差异。

从以上结果表明，通过使用本发明的载体，能够在施用载体的数十天后，从极少量的血浆样品中足以测定出目的蛋白质的血液中浓度。

实施例2、比较例2

以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggcttgtcttggactccagagg-3’，5’-gcagcatcgcggccgcgtctgaatctgggcatggttctgg-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。

通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图7至9以及序列号4所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠CTLA4-IgG-胰高血糖素^19-29(在大鼠CTLA4编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达CTLA4-IgG-胰高血糖素^19-29的重组载体(实施例2)。为了比较，制备了插入有不含CTLA4编码区域仅插入IgG-胰高血糖素^19-29编码区域的重组载体(比较例2)。

对心脏移植后的大鼠以与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，研究移植心脏的附着生长天数。

结果示于图10和图11中。如图10所示，实施例2中，CTLA4-IgG-胰高血糖素^19-29蛋白的变化如图7所示。就是说，尽管在100倍稀释物中无法测定胰高血糖素之前的值，但一天后急剧上升，显示出超过5000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出超过1000ng/ml的蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第105天后。此外，如图11所示，实施例2中，10只中有1只在14天时被排斥，直至检测的第105天剩下的9只都附着生长。用不含CTLA4的pCAGGS-SP-IgG-glu^19-29治疗的组中(实施例2)，5只中有1只在第5天时，1只在第6天时，3只在第7天时被排斥，这些显著地显示出pCAGGS-CTLA4-IgG-glu^19-29治疗的有效性。

实施例3、比较例3

以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggcactctgggtgactgcagtc-3’，5’-gcagcatcgcggccgcgtggccatagcggaaaagttgctt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和NotI将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。

通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图12至14以及序列号5所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL13-IgG-胰高血糖素^19-29(在大鼠白介素13(IL13)编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL13-IgG-胰高血糖素^19-29的重组载体(实施例3)。为了比较，制备了插入有不含IL13编码区域的仅插入有SP-IgG-胰高血糖素^19-29编码区域(序列表序列号6及图15和图16)的重组载体(比较例3)。

对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cellmyocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosinfraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积率。

结果示于图17和图18中。IL13-IgG-胰高血糖素^19-29蛋白的变化如图17所示。换句话说，第1天时呈现超过2000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出约8ng/ml的蛋白浓度直至检测的宰杀后的第16天后。此外，如图18所示，施用本发明基因治疗用载体pCAGGS-IL13-IgG-glu^19-29(插入IL13-IgG-glu^19-29的载体pCAGGS)的组，与施用不含IL13的pCAGGS-SP-IgG-glu^19-29的组相比，心肌炎病变部位的面积明显更小，显示出了pCAGGS-IL13-IgG-glu^19-29治疗的有效性。

实施例4、比较例4

以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggaaatctgctggggaccctac-3’，5’-gcagcatcgcggccgcttggtcttcctggaagtagaactt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。

通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图19至21以及序列号7所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL1RA-IgG-胰高血糖素^19-29(在大鼠白介素1受体拮抗剂编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL1RA-IgG-胰高血糖素^19-29的重组载体(实施例4)。

对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cellmyocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosinfraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积率。为了比较，施用比较例3的载体(比较例4)。

结果示于图22和图23中。如图22所示，实施例4中，IL1RA-IgG-胰高血糖素^19-29蛋白的变化如图22所示。就是说，第1天时呈现超过2000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，呈现出约20ng/ml的蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第16天后。此外，如图23所示，实施例4与比较例4相比，心肌炎病变部位的面积明显更小，显示出了pCAGGS-IL1RA-IgG-glu^19-29治疗的有效性。

实施例5

为了制备插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的pCAGGS-glu^19-29，以5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccccgggtaaagcccaagattttgtgcagtggttg-3’，5’-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用EcoR I整合入pCAGGS的克隆位点。

接着，以Cos7细胞的cDNA为模板，以5’-gagaattcatttaaatgacttccaagctggccgtggct-3’，5’-gcagcatcgcggccgctgaattctcagccctcttcaaaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将这些PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-glu19-29中。

通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图24以及序列号8所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的人IL8-胰高血糖素^19-29(在人白介素8编码区域的下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL8-胰高血糖素^19-29的重组载体(实施例5)。

对大鼠，按与实施例1同样方式施用重组载体，1天后采血，测定血液中浓度。同时，定量相同试样中人IL-8的浓度。人IL-8的浓度的定量采用BIOSOURSE公司(Nivelles，Belgium)制造的IL-8EASIA试剂盒按照其说明书进行。

结果示于图25中。如图25所示，两者的摩尔浓度大致相同，这证明了用胰高血糖素^19-29标记肽的方法的正确性。

                       序列表

<110>NIIGATA TLO CORPORATION

<120>基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体

在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定量的方法

<130>03PF275-PCT

<150>JP 2003-3967

<151>2003-01-10

<160>24

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>编码人，小鼠或大鼠胰高血糖素C19-29区域的寡肽

<400>1

Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

1               5                   10

<210>2

<211>1471

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1461)

<223>编码大鼠IFN-r受体，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物

<400>2

gaattcatttaa atg att ctg ctg gtg gtc ctg atg ctg tct gcg gag atc    51

             Met Ile Leu Leu Val Val Leu Met Leu Ser Ala Glu Ile

             1               5                   10

ggg agt gga gct ttg atg agc acc gag gat cct aag ccg ccc tcg gtg     99

Gly Ser Gly Ala Leu Met Ser Thr Glu Asp Pro Lys Pro Pro Ser Val

    15                  20                  25

cct gcg cca aca aat gtt cta att acg tcc tat gac ttg aac cct gtc    147

Pro Ala Pro Thr Asn Val Leu Ile Thr Ser Tyr Asp Leu Asn Pro Val

30                  35                  40                  45

gta cat tgg aag cac cag aac gtg tcg cag gct gcc gtc ttc act gta    195

Val His Trp Lys His Gln Asn Val Ser Gln Ala Ala Val Phe Thr Val

                50                  55                  60

cag gta aag atg tat cca gaa tac tgg act gat gcc tgc acc aac att    243

Gln Val Lys Met Tyr Pro Glu Tyr Trp Thr Asp Ala Cys Thr Asn Ile

            65                  70                  75

gcc cat cat tat tgt aat atc tac aaa cac att tcc tat cct gac tca    291

Ala His His Tyr Cys Asn Ile Tyr Lys His Ile Ser Tyr Pro Asp Ser

        80                  85                  90

tct gcc tgg gcc aga gtt aag gcc aag gtt gga caa aga gaa tct gcc    339

Ser Ala Trp Ala Arg Val Lys Ala Lys Val Gly Gln Arg Glu Ser Ala

    95                  100                 105

tat gcg cag tca gaa gag ttt att atg tgc cga aag ggg aag gtt gga    387

Tyr Ala Gln Ser Glu Glu Phe Ile Met Cys Arg Lys Gly Lys Val Gly

110                 115                 120                 125

ccg cct ggc ctg gac atc gga agg aag gaa gat cag ctg att gtc cac    435

Pro Pro Gly Leu Asp Ile Gly Arg Lys Glu Asp Gln Leu Ile Val His

                130                 135                 140

ata ttt cac cct aag gtc aat gtg agt cag gaa acc atg ttt ggt gac    483

Ile Phe His Pro Lys Val Asn Val Ser Gln Glu Thr Met Phe Gly Asp

            145                 150                 155

gga aat acc tgt tac aca ttc gac tac act gtg ttt gtg aaa cat tac    531

Gly Asn Thr Cys Tyr Thr Phe Asp Tyr Thr Val Phe Val Lys His Tyr

        160                 165                 170

agg agt ggg gag atc cta cat aca gaa cat agc gtc cta aaa gaa gat    579

Arg Ser Gly Glu Ile Leu His Thr Glu His Ser Val Leu Lys Glu Asp

    175                 180                 185

tgt agc gaa act ctg tgt gag tta aac atc tca gtg tcc acg ctg aat    627

Cys Ser Glu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Ile Ser Val Ser Thr Leu Asn

190                 195                 200                 205

tcc aat tac tgt gtt tca gta gtt gga aag tcg tct ttc tgg caa gtt    675

Ser Asn Tyr Cys Val Ser Val Val Gly Lys Ser Ser Phe Trp Gln Val

                210                 215                 220

aat aca gaa aca tca aaa gac gcc tgt atc ccc ttt ctc cat gat gac    723

Asn Thr Glu Thr Ser Lys Asp Ala Cys Ile Pro Phe Leu His Asp Asp

            225                 230                 235

aga gaa gaa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag    771

Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys

        240                 245                 250

cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc    819

Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

    255                 260                 265

cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc acg    867

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

270                 275                 280                 285

tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc    915

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser

                290                 295                 300

tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca cca    963

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro

            305                 310                 315

gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc    1011

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

        320                 325                 330

ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc    1059

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr

    335                 340                 345

agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa    1107

Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu

350                 355                 360                 365

ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag gaa    1155

Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu

                370                 375                 380

gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc    1203

Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe

            385                 390                 395

tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca cag    1251

Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln

        400                 405                 410

gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt tac    1299

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

    415                 420                 425

ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga    1347

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly

430                 435                 440                 445

aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat    1395

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

                450                 455                 460

actgag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg     1443

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val

            465                 470                 475

cag tgg ttg atg aat acc tgagaattct                                 1471

Gln Trp Leu Met Asn Thr

        480

<210>3

<211>4790

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工表达载体pCAGGS的DNA序列

<400>3

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata   60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc  120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag  180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac     240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg     300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg     360

tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc     420

atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca     480

gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg     540

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt     600

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc     660

gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc     720

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc     780

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag     840

ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg     900

tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg     960

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc    1020

ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg    1080

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc    1140

cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc    1200

gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg    1260

ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct    1320

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg    1380

gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc    1440

tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt    1500

cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg    1560

acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg    1620

gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca    1680

acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgag gaattcactc    1740

ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca    1800

aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg    1860

agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt    1920

ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg    1980

agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg    2040

ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga    2100

aaagccttga cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta    2160

acatccctaa aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta    2220

ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt    2280

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca    2340

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact    2400

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagcg    2460

gatccgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc    2520

ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat    2580

gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt    2640

ggaggcctag gcttttgcaa aaagctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat    2700

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg    2760

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ccgctgcatt aatgaatcgg    2820

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga    2880

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat    2940

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca    3000

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc    3060

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata    3120

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc    3180

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc    3240

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga    3300

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc    3360

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag    3420

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag    3480

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag    3540

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca    3600

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga    3660

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat    3720

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga    3780

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg    3840

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga    3900

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc    3960

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac    4020

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc    4080

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc    4140

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc    4200

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt    4260

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc    4320

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg    4380

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag    4440

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat    4500

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc    4560

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa    4620

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta    4680

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa    4740

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg               4790

<210>4

<211>1233

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1224)

<223>编码大鼠CTLA4，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物

<400>4

gaattcattt aa atg gct tgt ctt gga ctc cag agg tac aaa act cac ctg    51

              Met Ala Cys Leu Gly Leu Gln Arg Tyr Lys Thr His Leu

              1               5                   10

cag ctg cct tct agg act tgg cct ttt gga gtc ctg ctt tct ctt ctc      99

Gln Leu Pro Ser Arg Thr Trp Pro Phe Gly Val Leu Leu Ser Leu Leu

    15                  20                  25

ttc atc cca atc ttc tct gaa gcc ata caa gtg acc caa cct tca gtg     147

Phe Ile Pro Ile Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val

30                  35                  40                  45

gtg ttg gcc agc agc cac ggt gtc gcc agc ttt cca tgt gaa tat gca    195

Val Leu Ala Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ala

                50                  55                   60

tct tca cac aac act gat gag gtc cgg gtg acg gtg ctg cgg cag aca    243

Ser Ser His Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr

            65                  70                  75

aat gac caa gtg aca gag gtc tgt gcc acg aca ttc aca gtg aag aac    291

Asn Asp Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Val Lys Asn

        80                  85                  90

acg ttg ggc ttc cta gat gac ccc ttc tgc agt ggt acc ttt aat gaa    339

Thr Leu Gly Phe Leu Asp Asp Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu

    95                  100                 105

agc aga gtg aac ctc acc atc caa gga ctg agg gct gct gac acc gga    387

Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly

110                 115                 120                 125

ctg tac ttc tgc aag gtg gaa ctc atg tac cca ccg cca tac ttt gtg    435

Leu Tyr Phe Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val

                130                 135                 140

ggc atg ggc aac ggg acc cag att tat gtc atc gat cca gaa cca tgc    483

Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys

            145                 150                 155

cca gat tca gac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc    531

Pro Asp Ser Asp Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys

        160                 165                 170

aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc    579

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

    175                 180                 185

ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc    627

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

190                 195                 200                 205

acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc    675

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe

                210                 215                 220

agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca    723

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro

            225                 230                 235

cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc    771

Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

        240                 245                 250

atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc    819

Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val

    255                 260                 265

acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc    867

Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro

270                 275                 280                 285

gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag    915

Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys

                290                 295                 300

gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc    963

Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly

            305                 310                 315

ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca   1011

Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro

        320                 325                 330

cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt   1059

Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser

    335                 340                 345

tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag   1107

Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln

350                 355                 360                 365

gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac   1155

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

                370                 375                 380

cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt   1203

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe

            385                390             395

gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                              1233

Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

    400

<210>5

<211>1143

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1134)

<223>编码大鼠CTLA4，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物

<400>5

gaattcattt aa atg gca ctc tgg gtg act gca gtc ctg gct ctc gct tgc  51

              Met Ala Leu Trp Val Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Cys

              1               5                   10

ctt ggt ggt ctt gcc acc cca ggg cca gtg cgg aga tcc aca tct ccc    99

Leu Gly Gly Leu Ala Thr Pro Gly Pro Val Arg Arg Ser Thr Ser Pro

    15                  20                  25

cct gtg gcc ctc agg gag ctt atc gag gag ctg agc aac atc aca caa   147

Pro Val Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln

30                  35                  40                  45

gac cag aag act tcc ctg tgc aac agc agc atg gta tgg agc gtg gac   195

Asp Gln Lys Thr Ser Leu Cys Asn Ser Ser Met Val Trp Ser Val Asp

                50                  55                  60

ctg aca gct ggc ggg ttc tgt gca gcc ctg gaa tcc ctg acc aac atc   243

Leu Thr Ala Gly Gly Phe Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Thr Asn Ile

            65                  70                  75

tcc agt tgc aat gcc atc cac agg acc cag agg ata ttg aat ggc ctc   291

Ser Ser Cys Asn Ala Ile His Arg Thr Gln Arg Ile Leu Asn Gly Leu

        80                  85                  90

tgt aac caa aag gcc tcg gat gtg gct tcc agc ccc cca gat acc aaa   339

Cys Asn Gln Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Ser Pro Pro Asp Thr Lys

    95                  100                 105

atc gaa gta gcc cag ttt ata tca aaa ctg ctc aat tac tcc aag caa    387

Ile Glu Val Ala Gln Phe Ile Ser Lys Leu Leu Asn Tyr Ser Lys Gln

110                 115                 120                 125

ctt ttc cgc tat ggc cac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt    435

Leu Phe Arg Tyr Gly His Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly

                130                 135                 140

gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc    483

Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe

            145                 150                 155

atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct    531

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

        160                 165                 170

aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc    579

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val

    175                 180                 185

cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act    627

His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

190                 195                 200                 205

cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa    675

Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

                210                 215                 220

ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc    723

Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys

            225                 230                 235

aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc    771

Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

        240                 245                 250

aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct    819

Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro

    255                 260                 265

acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta    867

Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val

270                 275                 280                 285

aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg    915

Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly

                290                 295                 300

cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat    963

Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp

            305                 310                 315

ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg    1011

Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp

        320                 325                 330

cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac    1059

Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

    335                 340                 345

aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa    1107

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln

350                 355                 360                 365

gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                      1143

Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

                370

<210>6

<211>825

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(816)

<223>编码大鼠信号肽，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物

<400>6

gaattcatttaa atg aag tcc tgc ggc ctg ttc cct ctc atg gtg ctc ctt    51

             Met Lys Ser Cys Gly Leu Phe Pro Leu Met Val Leu Leu

             1               5                   10

gct ctg ggt gta ctg gca ccc tgg agt gtg gaa gga gcg gcc gcc gtg     99

Ala Leu Gly Val Leu Ala Pro Trp Ser Val Glu Gly Ala Ala Ala Val

    15                  20                  25

ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca    147

Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser

30                  35                  40                  45

gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc    195

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

                50                  55                  60

acc atc act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc    243

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

            65                  70                  75

cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa    291

Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

        80                  85                  90

gtc cac aca gct cag act cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act    339

Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

    95                  100                 105

ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat    387

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

110                 115                 120                 125

ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc    435

Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro

                130                 135                 140

atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat    483

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His

            145                 150                 155

gta tac acc atg tca cct acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc    531

Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val

        160                 165                 170

agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg    579

Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val

    175                 180                 185

gagtgg cag atg aac ggg cag cca cag gaa aac  tac aag aac act cca    627

Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro

190                 195                 200                 205

cct acg atg gac aca gat ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat    675

Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn

                210                 215                 220

gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg    723

Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

            225                 230                 235

ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac    771

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

        240                 245                 250

tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc        816

Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

    255                 260                 265

tgagaat tc                                                         825

<210>7

<211>1284

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1275)

<223>编码大鼠IL1受体拮抗剂，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入

物

<400>7

gaattcatttaa atg gaa atc tgc tgg gga ccc tac agt cac cta atc tct    51

             Met Glu Ile Cys Trp Gly Pro Tyr Ser His Leu Ile Ser

             1               5                   10

ctc ctt ctc atc ctt ctg ttt cat tca gag gca gcc tgc cgc cct tct     99

Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe His Ser Glu Ala Ala Cys Arg Pro Ser

    15                  20                  25

ggg aaa aga ccc tgc aag atg caa gcc ttc aga atc tgg gat act aac    147

Gly Lys Arg Pro Cys Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Thr Asn

30                  35                  40                  45

cag aag acc ttt tac ctg aga aac aac cag ctc att gct ggg tac tta    195

Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Leu

                50                  55                  60

caa gga cca aat atc aaa cta gaa gaa aag ata gac atg gtg cct att    243

Gln Gly Pro Asn Ile Lys Leu Glu Glu Lys Ile Asp Met Val Pro Ile

            65                  70                  75

gac ctt cat agt gtg ttc ttg ggc atc cac ggg ggc aag ctg tgc ctg    291

Asp Leu His Ser Val Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Leu Cys Leu

        80                  85                  90

tct tgt gcc aag tct gga gat gat atc aag ctc cag ctg gag gaa gtt    339

Ser Cys Ala Lys Ser Gly Asp Asp Ile Lys Leu Gln Leu Glu Glu Val

    95                  100                 105

aac atc act gat ctg agc aag aac aaa gaa gaa gac aag cgc ttt acc    387

Asn Ile Thr Asp Leu Ser Lys Asn Lys Glu Glu Asp Lys Arg Phe Thr

110                 115                 120                 125

ttc atc cgc tct gag aaa ggc ccc acc acc agc ttt gag tca gct gcc    435

Phe Ile Arg Ser Glu Lys Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala

                130                 135                 140

tgt cca gga tgg ttc ctc tgc aca aca cta gag gct gac cgt cct gtg    483

Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Thr Leu Glu Ala Asp Arg Pro Val

            145                 150                 155

agc ctc acc aac aca ccg gaa gag ccc ctt ata gtc acg aag ttc tac    531

Ser Leu Thr Asn Thr Pro Glu Glu Pro Leu Ile Val Thr Lys Phe Tyr

        160                 165                 170

ttc cag gaa gac caa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat    579

Phe Gln Glu Asp Gln Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp

    175                 180                 185

tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc    627

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

190                 195                 200                 205

ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag    675

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

                210                 215                 220

gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat    723

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His

            225                 230                 235

ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga    771

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg

        240                 245                 250

cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc    819

Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

    255                 260                 265

ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag    867

Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys

270                 275                 280                 285

gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa    915

Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

                290                 295                 300

ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc    963

Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr

            305                 310                 315

aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa    1011

Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys

        320                 325                 330

ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag    l059

Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln

    335                 340                 345

cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg    1107

Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly

350                 355                 360                 365

agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag    1155

Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln

                370                 375                 380

cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac    1203

Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

            385                 390                 395

cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat    1251

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp

        400                 405                 410

ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                          1284

Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

    415                 420

<210>8

<211>369

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(360)

<223>编码人IL8和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物

<400>8

gaattcattt aa atg act tcc aag ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc  51

              Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe

              1               5                   10

ctg att tct gca gct ctg tgt gaa ggt gca gtt ttg cca agg agt gct    99

Leu Ile Ser Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala

    15                  20                  25

aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac    147

Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His

30                  35                  40                  45

ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca cac tgc    195

Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys

                50                  55                  60

gcc aac aca gaa att att gta aag ctt tct gat gga aga gag ctc tgt    243

Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys

            65                  70                  75

ctg gac ccc aag gaa aac tgg gtg cag agg gtt gtg gag aag ttt ttg    291

Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu

        80                  85                  90

aag agg gct gag aat tca gcg gcc gcc ccg ggt aaa gcc caa gat ttt    339

Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Ala Ala Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe

    95                  100                 105

gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                               369

Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

110                 115

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>9

gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg                    45

<210>10

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>10

tcaaccactg cacaaaatct tgggctttac ccggagagtg ggagagact                49

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>11

gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg                     45

<210>12

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>12

gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc               50

<210>13

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>13

gagaattcat ttaaatgatt ctgctggtgg tcctgatg                            38

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>14

gcagcatcgcggccgcttct tctctgtcat catggagaaa                           40

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>15

gagaattcatttaaatggct tgtcttggac tccagagg                             38

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>16

gcagcatcgc ggccgcgtct gaatctgggc atggttctgg                          40

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>17

gagaattcat ttaaatggca ctctgggtga ctgcagtc                            38

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>18

gcagcatcgc ggccgcgtgg ccatagcgga aaagttgctt                          40

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>19

gagaattcat ttaaatggaa atctgctggg gaccctac                            38

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>20

gcagcatcgc ggccgcttgg tcttcctgga agtagaactt                          40

<210>21

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>21

gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccc cgggtaaagc ccaagatttt gtgcagtggt  60

tg                                                                 62

<210>22

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>22

gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc               50

<210>23

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>23

gagaattcat ttaaatgact tccaagctgg ccgtggct                            38

<210>24

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物

<400>24

gcagcatcgc ggccgctgaa ttctcagccc tcttcaaaaa                          40