摘要：目的:老年性痴呆病理特征之一为脑内神经元纤维缠结,高度磷酸化的微管相关蛋白Tau蛋白是NFTs的主要成分.Tau蛋白的磷酸化主要受蛋白激酶与磷酸酯酶的调节.山茱萸环烯醚萜苷是本室从中药山茱萸中提取的有效部位.本实验探讨CIG对微管相关蛋白tau过度磷酸化的抑制作用及其药理机制.方法:采用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) 抑制剂wortmannin及激酶A(PKA)抑制剂GF-109203X(WT/GFX)与人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH共孵育,建立微管相关蛋白tau过度磷酸化拟阿尔茨海默病细胞模型.实验分为空白对照,空白给药组(100mg/L),WT/GFX组,CIG小剂量组(50mg/L),CIG中剂量组(100mg/L),CIG大剂量组(200mg/L).CIG与SK-N-SH细胞预孵育24 h,再用 WT和GFX与SK-N-SH细胞共孵育 3h.采用相差显微镜观察细胞形态结构;激光共聚焦方法观察微管形态结构;Western blotting方法观察不同位点磷酸化tau蛋白的表达水平及相关通路中p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、PP2A、DM-PP2A (demethyled PP2A),PP2A甲基转移酶(LCMT)及甲基酯酶(PME1)的表达.结果与讨论:WT/GFX抑制 p-Akt-ser473和p-GSK-3β-ser9、从而引起GSK-3β活性增高导致tau蛋白磷酸化.CIG中剂量和大剂量组能够明显降低模型细胞tau蛋白在Thr212,Ser214,Ser396/Ser404,Thr217,Thr205位点的磷酸化水平.微管相关蛋白tau正常情况下其主要生物学功能是促进微管组装和维持微管的稳定性. 本实验中发现WT/GFX破坏细胞骨架结构,导致细胞胞体变圆,突起断裂不连续,CIG能够使损伤的微管形态基本恢复正常,保护细胞形态完整,这与CIG能够抑制tau蛋白磷酸化相关.CIG对GSK-3β-ser9和p-Akt-ser473的表达没有明显改变.有研究表示GSK-3β的激活可以引起PP2A活性明显下降.本实验中发现,WT/GFX模型组PP2A明显下降,CIG能够提高PP2A活性.CIG能够抑制去甲基化PP2A的表达,抑制PME1/LCMT(PP2A甲基酯酶和甲基转移酶)的比值.虽然CIG对GSK-3β-ser9和p-Akt-ser473的表达没有明显改变,但可以显著降低PME1/LCMT的比值,减少DM-PP2A的表达,从而提高磷酸酯酶的活性,增加tau蛋白去磷酸化.结论:CIG能够降低tau蛋白在多个位点的过度磷酸化修饰,从而保护微管结构和细胞形态完整.其降低tau蛋白过度磷酸化修饰可能是通过调节PME1和LCMT的表达,从而降低PP2A的非甲基化提高PP2A活性从而使tau蛋白去磷酸化.CIG对tau蛋白过度磷酸化的抑制作用,对AD治疗具有应用前景.
