cDNA克隆

摘要： 真核生物翻译起始因子4G(eIF4G)充当衔接eIF4F复合体的骨架蛋白,在帽依赖性翻译起始中起关键作用.为探究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)eIF4G基因在幼体发育阶段的作用,本研究利用RACE技术克隆了中华绒螯蟹eIF4G基因(命名为EseIF4G)的全长cDNA序列,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在幼蟹不同发育阶段的mRNA表达模式,并探讨其在节肢动物进化过程中是否发生了适应性进化.生物信息学分析显示,EseIF4G基因的cDNA全长为3769 bp,包含一个2379 bp的开放阅读框,编码792个氨基酸;该编码蛋白具有保守的MIF4G、MA3和W2结构域,无跨膜区、疏水性区域和信号肽,是不稳定且非分泌型蛋白.荧光定量PCR检测显示,EseIF4G基因在中华绒螯蟹受精卵、溞状幼体Ⅰ~Ⅴ期、大眼幼体期和仔蟹Ⅰ~Ⅲ期共10个幼体发育阶段广泛表达,EseIF4G基因mRNA表达量在卵至溞状幼体Ⅳ期相对较高,而在溞状幼体Ⅴ期至仔蟹Ⅱ期相对较低,在溞状幼体Ⅴ期降至最低,与在仔蟹Ⅱ期的表达量没有显著差异(P>0.05).选择压力分析显示,PAML的位点模型和分支位点模型没有鉴定出正选择位点,分支模型在中华绒螯蟹末端分支没有检测到正选择信号;利用Datamonkey在EseIF4G的氨基酸水平鉴定出两个正选择位点(448G和655N).现有数据表明,EseIF4G基因可能参与中华绒螯蟹幼蟹发育过程,特别是短尾化过程,调控mRNA翻译和蛋白质相互作用;同时,其在节肢动物进化过程中进化相对保守.

摘要： 旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因(ADAR2)全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索.利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾、脾、脑、小肠、背最长肌和背部脂肪9种组织中ADAR2的表达水平.结果表明,猪ADAR2基因cDNA全长6 305 bp,共包含12个外显子,编码704个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的CDS区核酸序列和氨基酸序列的一致性均在84％以上.该基因编码的蛋白含有2个双链RNA结合基序和一个脱氨酶结构域.猪ADAR2在检测的各组织中均表达,其中在肺中的表达量最高.综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR2基因全长cDNA序列,并且发现其在猪体内广泛表达,为深入研究ADAR2的功能奠定了良好的基础.

摘要： 为研究环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase)基因在滇牡丹生物合成中的作用机制,该文采用RT-PCR技术首次从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到一个具完整开放阅读框的环阿屯醇合成酶基因(PdCAS),该基因全长2274 bp,共编码757个氨基酸,PdCAS蛋白序列与桃(Prunus persica)、日本裸樱(Prunus yedoensis var.nudiflora)、葡萄(Vitis vinifera)蛋白序列相似性在86％以上.序列比对分析显示PdCAS具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和三萜合成酶的标志性序列DGSWYGSWGVCFTYG.滇牡丹PdCAS蛋白与蔷薇科植物苹果(Malus domestica XP 008391430.1)、白梨(Pyrus bretschneideri XP 009370034.1)、月季(Rosa chinensis XP 024193310.1)、日本裸樱(Prunus yedoensis var.nudiflora PQQ11009.1)、桃(Prunus persica XP 007225240.1)的CAS蛋白聚为一类.PdCAS基因在滇牡丹各组织中均有表达,但是在花瓣中表达量较高.该研究克隆的PdCAS基因与滇牡丹甾醇类化合物的合成密切相关.

摘要： [目的]克氏原螯虾(Procambarus clarkii)属于节肢动物门甲壳纲十足目,也称淡水小龙虾.多巴脱羧酶(dopa decarboxylase)作为小龙虾先天免疫应答中的一种关键酶,在抵御外来病原体的侵害上起到了重要作用.本研究以克氏原螯虾为材料,克隆了Pc-ddc cDNA序列并对其进行生物信息学及组织mRNA表达分析.[方法]通过分子生物学技术构建大肠杆菌表达载体,并进行生物信息学分析,同时应用qRT-PCR技术分析其mRNA组织表达分布.[结果]生物信息学分析表明:获得了开放阅读框全长为1 425 bp的Pc-ddc基因的cDNA序列,编码474个氨基酸残基,多肽的理论分子量为52.99ku,蛋白分子式为C2384H3689N647O674S25,等电点为5.98,为弱酸性蛋白且N-末端无信号肽.亚细胞定位表明:Pc-DDC蛋白在线粒体中最多;组织表达分析表明:Pc-ddc mRNA在检测的6个组织中差异表达,其中,淋巴组织表达量最高.[结论]本研究为克氏原螯虾等无脊椎动物先天免疫系统的深入探索提供了理论支撑.

摘要： 三氯生(TCS)是一种广谱高效抗菌剂,在水环境和生物体内均不同程度检出,对水生生物具有潜在风险.P-糖蛋白(P-gp)是生物体多型异源物质抗性防御系统中重要的"膜解毒蛋白",对水生生物体内的有毒物质和代谢产物具有重要的外排和转运作用.为探究P-gp在鱼类免疫中的作用,克隆了食蚊鱼(Gambusia affinis)P-gp基因的cDNA,检测了不同浓度(50、100和150 g·L-1)TCS暴露12 h、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d后,P-gp mRNA相对表达量的变化.实验获得的食蚊鱼P-gp cDNA共5452 bp,编码1294个氨基酸,具有ABC转运蛋白家族典型的跨膜结构、功能区域和作用位点,与其他鳉形目的鱼类P-gp氨基酸序列同源性较高.TCS对P-gp mRNA表达的影响呈现倒"U"型的时间-剂量效应,50 g·L-1和100 g·L-1 TCS胁迫后P-gp表达量先升高后下降,100 g·L-1暴露组表达高峰在暴露1 d时,50 g·L-1 TCS暴露组表达高峰延迟至3 d,而150 g·L-1暴露组P-gp表达无显著变化.结果表明,P-gp基因参与了TCS胁迫的解毒过程,有助于食蚊鱼抵抗外源污染物的毒性作用.

摘要： Crustins是一类较早发现并广泛分布在甲壳动物中且富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,能够参与抗菌免疫应答.从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中克隆获得一个Crustin基因新变体,命名为SpCrus1a,其cDNA序列全长744 bp,开放阅读框编码113个氨基酸,成熟肽分子质量10.03 ku,理论等电点8.30.表达分析结果发现其转录本主要存在于鳃、卵巢、上皮组织中,经脂多糖刺激后SpCrus1a表达会上调.体外合成SpCrus1a的第29～47位氨基酸(S pCrus1a29-47)进行抗菌活性实验,发现其对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性,而对被测的革兰氏阴性菌抗菌活性较弱或无抗菌活性.浓度24μmol/L的合成肽SpCrus1a29-47能够在5 min内杀死大多数的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),在120 min内杀死全部的金黄色葡萄球菌.扫描电镜分析发现合成肽S pCrus1a29-47可造成金黄色葡萄球菌表面结构崎岖不平,高浓度SpCrus1a29-47会引起细菌大量死亡.上述结果表明SpCrus1a是抗菌肽Crustin的新变体.

摘要： Objective To explore the clinical and genetic features of an infant with citrin deficiency (CD).Methods Clinical data of the patient was collected and analyzed.Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples collected from the patient and her parents.Targeted exome sequencing was performed to explore the genetic cause,and Sanger sequencing was used to confirm the detected variants.SLC25A13 mRNA was extracted from peripheral blood lymphocytes of the infant.The effect of novel mutation of SLC25A13 was analyzed by reverse transcription-PCR,cDNA cloning and Sanger sequencing.Results The SLC25A13 genotype of the patient was determined as c.845_c.848+1delG/c.1841+3_1841+4delAA,with the latter having not been reported.The mutation has affected the splicing of the SLC25A13 mRNA,giving rise to an aberrant transcript [r.1841_1842ins1841+1_1841+67;1841+3_c.1841+4del].Conclusion A novel SLC25A13 mutation c.1841 + 3_1841+4delAA and the resultant abnormal splicing variant were discovered by combined DNA sequencing and cDNA cloning.The finding has enabled definite diagnosis of CD and enriched the spectrum of SLC25A13 mutations.%目的 探讨1例希特林缺陷病患儿的临床及遗传学特征.方法 整理分析患儿临床资料,提取患儿及其父母外周血DNA标本,采用靶向外显子测序检测致病突变,并通过一代测序进行验证.提取患儿外周血淋巴细胞mRNA,通过逆转录-PCR、cDNA克隆和Sanger测序等技术,分析新突变对SLC25A13转录产物的影响.结果 患儿为SLC25 A13突变c.845_c.848+ 1delG和c.1841+ 3_1841+4delAA复合杂合子,后一突变尚未见文献报道,克隆结果证实该突变造成mRNA异常剪接,形成异常转录子[r.1841_1842ins1841+1_1841+67;1841+3_c.1841+4del].结论 本研究通过传统DNA分析方法结合cDNA克隆技术,发现了新突变c.1841+ 3_1841+ 4delAA及其异常剪接变异体,为患儿希特林缺陷病确诊提供了实验依据,同时扩展了SLC25A13基因突变谱.

摘要： 为探索驯鹿(Rangifer tarandus)Morf4l1基因的生物学特性以及雌、雄驯鹿茸顶端表皮组织表达差异,揭示Morf4l1对鹿茸生长的重要生物学意义,采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得驯鹿Morf4l1基因cDNA,以驯鹿Morf4l1基因cDNA为依据,展开生物信息分析和雌、雄驯鹿鹿茸表皮组织中表达差异的研究.结果表明:1)驯鹿Morf4l1基因CDS区全长为972bp,共编码323个氨基酸.2)驯鹿Morf4l1蛋白是一种相对分子量为37. 20ku的不具跨膜结构的亲水性蛋白质,其二级结构主要以β转角为主.3)驯鹿Morf4l1编码蛋白氨基酸序列与其他18个物种该蛋白氨基酸序列发现相似度介于85％～100％,其中与白尾鹿相似度最高为100％,与原鸡相似度最低为85％,与其他亲缘关系较近物种(如牛、羊)的相似度能达到99％;结合系统进化树发现驯鹿Morf4l1基因在进化中高度保守,各物种之间的遗传距离不超过0. 035.4)荧光定量结果显示雌性驯鹿茸顶端表皮组织Morf4l1基因相对表达量是雄性的2. 127±0. 032倍.本研究发现驯鹿Morf4l1基因在进化中高度保守,是鹿茸生长发育的关键基因,其在驯鹿鹿茸表皮组织中相对表达量受性别影响较为明显.%In order to explore the biological characteristics and expression of Morf4l1 gene in reindeer. RT-PCR and molecular cloning were used to obtain the cDNA of Morf4l1. Based on the information of Morf4l1 cDNA, a series of bioinformatics analysis was carried out. The results showed that:1)The full length of reindeer Morf4l1 CDS of was972bp, which encoded 323 amino acids. 2)Morf4l1 protein was a hydrophilic protein of 37. 20 ku without transmembrane structure, and its secondary structure was mainlyβ-sheet. 3)The amino acids sequence of Morf41 protein was compared with that of 18other species, the overall similarity was ranged 85％to 100％. The highest was white tail deer of 100％ and the lowest was Raw chicken of 85％. Other species such as cattle, sheep with reindeer close relatives, their highest similarity reached 99％;Through the phylogenetic tree analysis, it was found that reindeer Morf411 was highly conserved during the evolution, and the genetic distances among species were not more than 0. 035. 4)The fluorescence quantitative analysis showed that expression of Morf4l1 gene in the epidermis of female reindeer top antler was 2. 127±0. 032 times more than in the male. In conclusion, reindeer Morf4l1 gene was highly conserved during evolution and was an important for antler development. Its expression was affected by sex of reindeer.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 鱼类的性腺发育主要是由下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)来进行调控的.促性腺激素抑制激素(GnIH)是一种由动物下丘脑分泌的多肤类物质,其主要生物学功能是降低垂体细胞合成以及分泌促性腺激素,抑制性腺的发育.而RF肽家族由kiss基因编码的另一种短肽Kisspeptin与GnIH起着直接而相反的作用.多项研究结果证明,Kisspeptin与其特异性受体GPR54共同组成的Kisspeptin/GPR54系统对动物的繁殖具有重要作用.本文采用PCR技术克隆了同一时期的二倍体红鲫、三倍体湘云鲫以及异源四倍体鲫鲤gnih和两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列,对其进行同源性比较分析,并对其在二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤九种组织中的差异性表达进行研究.结果显示,在不同倍性鲫鲤中,gnih基因在脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢中均有表达,其中在精巢中大量表达;kiss1基因在脑、肾脏、肝脏、卵巢、垂体、脾脏、精巢组织中大量表达,而在心脏、肌肉中微量表达;kiss2基因在卵巢和精巢当中大量表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、垂体、脾脏组织当中微量表达.旨在为研究这些基因对二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤繁殖的调控作用提供理论基础,并为进一步了解和丰富三倍体不育的分子内分泌学机制提供科学依据.

摘要： 从2010年4月起,中国东南部分省份的部分鸭场发生一种以产蛋严重下降为主要特征的传染病,并迅速蔓延至我国各主要养鸭地区,给养鸭业造成巨大的经济及损失.本文通过对该病的流行病学调查、病原分离和动物感染回归实验证明其病原为一种与Tembusu病毒密切相关的黄病毒,并参照黄病毒命名惯例将其暂命名为BYD病毒,并在国际上率先给予报道,引起了广泛关注.本研究以BYDV-JX-SP分离株为基础,构建了该病毒的感染性cDNA克隆,以期为深入开展病毒的分子致病机制和防治技术研究奠定了基础.

摘要： 从2010年4月起,中国东南部分省份的部分鸭场发生一种以产蛋严重下降为主要特征的传染病,并迅速蔓延至我国各主要养鸭地区,给养鸭业造成巨大的经济及损失.本文通过对该病的流行病学调查、病原分离和动物感染回归实验证明其病原为一种与Tembusu病毒密切相关的黄病毒,并参照黄病毒命名惯例将其暂命名为BYD病毒,并在国际上率先给予报道,引起了广泛关注.本研究以BYDV-JX-SP分离株为基础,构建了该病毒的感染性cDNA克隆,以期为深入开展病毒的分子致病机制和防治技术研究奠定了基础.

摘要： 从2010年4月起,中国东南部分省份的部分鸭场发生一种以产蛋严重下降为主要特征的传染病,并迅速蔓延至我国各主要养鸭地区,给养鸭业造成巨大的经济及损失.本文通过对该病的流行病学调查、病原分离和动物感染回归实验证明其病原为一种与Tembusu病毒密切相关的黄病毒,并参照黄病毒命名惯例将其暂命名为BYD病毒,并在国际上率先给予报道,引起了广泛关注.本研究以BYDV-JX-SP分离株为基础,构建了该病毒的感染性cDNA克隆,以期为深入开展病毒的分子致病机制和防治技术研究奠定了基础.

摘要： 从2010年4月起,中国东南部分省份的部分鸭场发生一种以产蛋严重下降为主要特征的传染病,并迅速蔓延至我国各主要养鸭地区,给养鸭业造成巨大的经济及损失.本文通过对该病的流行病学调查、病原分离和动物感染回归实验证明其病原为一种与Tembusu病毒密切相关的黄病毒,并参照黄病毒命名惯例将其暂命名为BYD病毒,并在国际上率先给予报道,引起了广泛关注.本研究以BYDV-JX-SP分离株为基础,构建了该病毒的感染性cDNA克隆,以期为深入开展病毒的分子致病机制和防治技术研究奠定了基础.

摘要： 本发明提供一种有效地制备降低了高表达基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的方法。在使用具有寡脱氧胸苷酸的双链DNA引物、并且以mRNA为模板的cDNA文库的制备方法中，通过使具有结合到高表达的目的基因的mRNA、且阻止由逆转录酶而引起的cDNA延伸反应的特性的探针共存，从而降低cDNA文库中高表达基因来源的cDNA克隆的比例。

摘要： 本发明公开了一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用，属于病毒技术领域。本发明所用拯救系统在A型塞内卡病毒5’端上游引入CMV增强子、β‑actin启动子和核酶序列；在3’端下游引入核酶和终止子序列，通过RT‑RCR方法分段扩增SVA全长基因组片段，利用同源重组技术克隆至pOK12载体，构建含SVA/HeB全长cDNA的重组质粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒为深入研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础，具有重要的科学应用价值。

摘要： 本发明提供了A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明在对SVA/HN/11/2017兰兽研进行全基因组测定的基础上，在其基因组cDNA序列的5’端引入了T7启动子序列，在3’端引入Not I酶切位点序列，同时在2B基因处引入了Xho I酶切位点，消除了Xma I酶切位点，构建含SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA的重组质粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。本发明提供的感染性cDNA克隆及制备方法为深入开展SVA的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

摘要： 本发明公开了猫B淋巴细胞刺激因子cDNA及其编码蛋白、克隆方法和应用。该猫B淋巴细胞刺激因子cDNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明首次从猫中克隆到的猫B淋巴细胞刺激因子cBAFF的cDNA，荧光定量PCR分析cBAFF在各个检测组织中都有表达，在脾中表达量最高，在小肠中表达量最低；表明BAFF在猫的免疫系统中起重要作用。该基因的胞外区重组融合蛋白csBAFF行使cBAFF的活性功能，该蛋白对小鼠淋巴细胞具有明显的促存活/增值效应，本发明的猫B淋巴细胞刺激因子cDNA可以应用在生产重组猫B淋巴细胞刺激因子作为猫类免疫增强剂。

摘要： 本发明公开了犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用。本发明以犬瘟热病毒CDV‑3株为模板，将CDV‑3的全长分5个片段进行RT‑PCR扩增。经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体，同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列，获得犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆。然后，构建表达CDV‑3N、P、L蛋白的三个辅助质粒。将犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，获得拯救后的重组CDV‑3病毒(rCDV‑3)。研究发现，获得的rCDV‑3病毒滴度最高达到107.667TCID50/mL，比wtCDV‑3高出10倍。rCDV‑3感染Vero细胞后，于感染后36h迅速达到最高病毒滴度，而wtCDV‑3于感染后72h时病毒含量达到最高。本发明的提出为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究奠定了基础。

摘要： 本发明提供一种有效地制备降低了高表达基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的方法。在使用具有寡脱氧胸苷酸的双链DNA引物、并且以mRNA为模板的cDNA文库的制备方法中，通过使具有结合到高表达的目的基因的mRNA、且阻止由逆转录酶而引起的cDNA延伸反应的特性的探针共存，从而降低cDNA文库中高表达基因来源的cDNA克隆的比例。

摘要： 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。

摘要： 本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。

摘要： 本发明涉及一种SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法，具体的，结合In‑Fusion和Gibson Assembly无缝克隆对SARS‑CoV‑2基因组进行全长cDNA合成和克隆。构建了基于BAC载体的复制稳定且分子量更小的单拷贝质粒pBac‑mini(早期曾命名为pY1B，现统一命名为pBacm)，并将SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆至该载体，构建重组单拷贝质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2,利用Recombineering技术对全长cDNA进行有益的碱基改造及基因敲除等遗传工程改造。

摘要： 本发明提供了一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体及其构建方法和鉴定方法，所述甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。本发明将SCSMV全长cDNA序列分为A、B和C 3个重叠片段和pGreenII‑35S载体D片段进行扩增，通过Gibson技术进行拼接重组转化农杆菌，首次获得具备侵染活性的SCSMV全长cDNA侵染性克隆载体，将加大推动SCSMV与寄主的互作机制及致病机理的研究，为开发新的SCSMV科学防控技术提供理论依据。