降低了高表达基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的制备方法

摘要

本发明提供一种有效地制备降低了高表达基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的方法。在使用具有寡脱氧胸苷酸的双链DNA引物、并且以mRNA为模板的cDNA文库的制备方法中，通过使具有结合到高表达的目的基因的mRNA、且阻止由逆转录酶而引起的cDNA延伸反应的特性的探针共存，从而降低cDNA文库中高表达基因来源的cDNA克隆的比例。

说明书

技术领域

本发明为制备cDNA文库的方法，涉及降低了表达频度高的基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的制备方法。

背景技术

通过基因组计划，人、鼠、犬、线虫、酵母等各种生物的基因组DNA的全长序列已经基本被确定。在已迎来后基因组时代的今天，为了宏观地把握各个基因在生命现象中的作用，需要一种推进基因群动态的调查、且网罗式地解析所有基因的技术。

通常认为，构成人体的细胞具有编码约2.2万种基因的基因组，根据细胞类型而进行着数万种基因的表达(参照非专利文献1)。网罗式地调查这样的基因表达，不仅是在阐明生命现象方面，而且在基于基因信息来进行药品开发的方面也越发重要。尤其是，为了网罗式且详细地解析基因所编码的蛋白质的一级结构的相关信息，需要获取与mRNA互补的DNA、也即cDNA(complementary DNA)。

基因根据其表达量而大致分为3类。分别是：每个细胞表达12,000拷贝以上的高表达基因群、表达约300拷贝的中表达基因群、以及仅表达15拷贝左右的低表达基因群(参照非专利文献2)。以这样的表达量不同的mRNA混合物为模板来制备cDNA文库时，cDNA文库中所含的低表达基因克隆含有率比高表达基因的含有率会小三个数量级以上。因而，欲通过部分碱基序列网罗式地解析cDNA文库所含的cDNA克隆时，则会对高表达基因来源的克隆进行反复测序，需要做很多无用功。由于细胞内进行表达的很多基因是低表达基因，因而，正在开发降低这类高表达基因克隆的比例的方法。

其中，一种方法是利用了高表达基因cDNA的自缔合的方法。其为如下方法：首先，由mRNA制备双链cDNA，通过将其变性而使其变成单链。接着，进行退火反应，从通过重缔合而获得的双链cDNA和残留有单链状态的cDNA的混合物中，使单链cDNA吸附在羟基磷灰石上来回收。反复进行数次该操作，回收单链cDNA后，对其进行克隆。即，高表达基因由于其单链cDNA大量存在，因而退火反应中成为双链的概率高，但低表达基因由于其单链cDNA的含有率低，缔合频度低，因而就是以单链状态存在。此时，为回收未缔合的低表达基因来源的单链cDNA的方法(参照专利文献1)。

另一种方法是利用了与mRNA的杂交的方法。即，从现有的高表达基因cDNA转录mRNA，将其生物素化，接着，与作为对象的单链cDNA文库进行杂交。与固定化有亲和素的磁粒子反应，除去与该生物素化mRNA结合的cDNA，回收不与该粒子结合的cDNA，对其进行克隆，从而获得低表达基因的克隆(参照专利文献2)。

通过这些方法虽然能够制备提高了低表达基因的含有率的cDNA文库，但变得在从mRNA来制备cDNA文库后、增加了除去高表达基因的cDNA的工序，与通常的cDNA文库制备法相比，工序数变多。此外，由于低表达基因的cDNA也会非特异性损失，因而也存在其收率降低的问题。

对于这一现状，提出了在以mRNA为模板合成第一链cDNA的工序中，抑制高表达基因的第一链cDNA的合成的方法。即、为如下方法：在利用寡dT引物和逆转录酶由mRNA合成第一链cDNA的工序中，使与高表达基因的mRNA的3’末端附近特异性结合的探针共存，从而终止第一链cDNA的合成，通过RNA酶H处理将与探针结合的部分mRNA进行分解(参照专利文献3)。然而，被认为由于逆转录酶具有在转录时排除所结合的探针的活性，因而当使用与mRNA的任意位置结合的探针时，无法阻止第一链cDNA的合成。上述文献中，使用了与mRNA的3’末端附近结合的探针。

使用任一种方法时，均需要使单链cDNA形成双链cDNA后，重组到适当载体中的工序。该过程中会发生低表达基因cDNA克隆的损失，因而难以有效地获得低表达基因的全长cDNA克隆。由此，正在寻找一种有效地且以较少的工序数来制备高表达基因的含有率低的cDNA文库的方法。

非专利文献1：International Human Genome Sequencing Consortium，2004，Nature 432，931-945

非专利文献2：David J.Bertioli.，et al.，Nucleic Acids Research，1995，Vol.23，No.21，4520-4523

专利文献1：日本特开平4-108385号公报

专利文献2：日本特开2000-325080号公报

专利文献3：日本特开2000-37193号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于，提供一种有效地制备降低了来自于细胞等的mRNA中一种或多种高表达基因来源的cDNA的含有率的cDNA文库的方法。

解决问题的手段

本发明人等在利用国际公开第WO2004/087916号小册子中记载的双链DNA引物进行cDNA合成时发现了：在第一链cDNA的延伸反应时，使用相对于核酸试样中存在的高表达目的基因的探针、并使其共存，抑制第一链cDNA的延伸反应，抑制该基因来源的mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体的闭环反应，从而能够降低目的基因的cDNA克隆含有率，完成了本发明。即，本发明提供一种制备降低了作为高表达基因的目的基因的mRNA来源的cDNA含有率的cDNA文库的工序。

作为一个例子，本发明提供一种制备降低了目的基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库的方法，其特征在于，包括：

(i)：使双链DNA引物与含有在5’端具有帽状结构的mRNA的RNA混合物进行退火，进一步与至少一种结合到所述目的基因的mRNA上且抑制逆转录酶反应的探针进行退火的工序；

(ii)：通过逆转录酶由双链DNA引物合成第一链cDNA，制备mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体的工序；和

(iii)：将mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体的含有cDNA的DNA链的3’端和5’端用连接酶进行连接，使其环状化的工序。作为目的基因可使用高表达基因，可根据基因数据库来选择目的基因。

工序(i)的具有帽状结构的mRNA例如包含于细胞提取物中。使用的双链DNA引物的引物序列例如含有与具有帽状结构的mRNA的多聚(A)序列互补的序列。此外，作为连接酶例如可使用T4RNA连接酶。

在上述方法的工序(ii)和工序(iii)之间，可包括工序(ii′)：用限制性内切酶将mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体切断，从而在双链DNA引物的端部生成5’突出末端或平滑末端的工序。

此外，在上述方法的工序(iii)之后，还可以进一步包括工序(iv)：将mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体的RNA链置换为DNA链的工序。

此外，上述方法中，双链DNA引物还可以含有复制原点、或复制原点和cDNA表达用启动子。结合到目的基因的mRNA上且抑制逆转录酶反应的探针例如为如下的寡核苷酸：含有比目的基因的部分序列的互补序列的熔解温度(Tm值)高2℃以上的非天然型核酸、且从5’端侧起连续的2个以上碱基由非天然型核酸构成。这里，作为非天然型核酸可使用：锁核酸(Locked Nucleic Acid)、肽核酸(Polyamide Nucleic Acid)或交联核酸(Bridged Nucleic Acid)。结合到目的基因的mRNA上且抑制逆转录酶反应的探针可以分别以不同种类的目的基因的mRNA为对象。

进而，作为一个例子，本发明提供一种具有与mRNA序列互补的序列的探针，其由如下设计的寡核苷酸构成：其3’末端具有修饰成无法作为由逆转录酶引起的延伸反应的起始点的结构，且从5’末端起连续的2个以上碱基为非天然型核酸，且探针全体的碱基序列的Tm值比仅由天然型核酸构成的碱基序列的Tm值高2℃以上。

该探针例如是用于制备降低了目的基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库，结合到目的基因的mRNA上且抑制逆转录酶反应的探针。

进而，作为一个例子，本发明提供cDNA文库制备试剂盒，含有上述的探针、双链DNA引物、逆转录酶、以及T4RNA连接酶。

另外，本发明中，“双链DNA引物”是指双链DNA中的一个DNA链的3’端为突出状态，且该突出的部分的碱基序列(引物序列)具有与模板mRNA序列互补的碱基序列。该突出的部分与模板mRNA杂交，作为由逆转录酶合成第一链cDNA时的引物而发挥作用。以合成cDNA为目的时，使用突出的部分的序列由30～70个寡dT构成的双链DNA引物。

发明效果

根据本发明，能够以比现有方法少的工序数提供一种降低了来源于目的基因mRNA的cDNA的含有率的cDNA文库。以高表达基因作为目的基因时，制备的cDNA克隆中的低表达基因的含有率相对地提高，因而能够有效地获得低表达基因的完整的基因信息。进而，使得在现有方法中难以实现的、对极微量的表达基因进行cDNA的克隆化也能够实现。这些低表达量基因可以作为用于疾病的基因诊断、药品开发的目的基因而利用。

附图说明

图1是表示使用本发明提供的第一链cDNA延伸阻止法的cDNA合成方法的基本顺序的图。

图2是表示由本实施例中使用的RNA样品而制备的cDNA文库中所存在的基因的含有率的图。

图3是表示研究中所使用的探针序列的图。

图4是通过杂交求出各文库中的白蛋白1(Albumin 1)和主要尿蛋白2(Major urinary protein 2)的含有率的图。

图5是通过5’端碱基序列测定求出各文库中的白蛋白1和主要尿蛋白2的含有率的图。

具体实施方式

本说明书中包括了作为本申请优先权基础的日本专利申请2008-217245号的说明书和/或附图中记载的内容。

本发明的降低了目的基因来源的cDNA克隆含有率的cDNA文库，在使用国际公开第WO2004/087916号小册子中记载的双链DNA引物、用cDNA合成法来制备cDNA文库时，降低了特定的目的基因来源的cDNA的含有率。该cDNA合成方法为合成从与mRNA的帽状结构邻接的核苷酸起具有连续序列的cDNA的方法，能够以数μg级的总RNA为起始原料。此外，能够不使用PCR而合成cDNA，能够以较少工序合成cDNA。进而，还具有能够以90％以上的高收率合成全长cDNA的特征，其中，所述全长cDNA具有与从完整的mRNA的5’端帽状结构添加位点起至3’端的多聚(A)尾部的全长相应的碱基序列，该帽状结构添加位点确保了具有从所述转录起始点核苷酸起的连续序列。

作为mRNA的提供试样，可使用从真核生物的细胞分离得到的总RNA。此外，也可以使用由寡dT结合载体从该总RNA纯化而得的具有多聚A结构的mRNA。优选的是，这些含有mRNA的提供试样为分解较少的试样。即，优选的是，该RNA样品中包括了5’末端具有帽状结构、3’末端具有多聚A的完整的mRNA。本发明中的“含有带帽状结构的mRNA的RNA混合物”既可以是基本上仅由具有帽状结构的mRNA组成的混合物，此外也可以含有不具有帽状结构的mRNA等。

作为cDNA文库中的使cDNA克隆含有率降低了的目的基因，可以选择任意的基因，但从现有的方法中难以实现的、制备较多地含有低表达基因的cDNA文库的观点出发，优选为高表达基因。这里，高表达基因是指表达量高、且在mRNA试样中含有较多的该mRNA的基因。高表达基因是指例如每个细胞存在约12,000拷贝以上的基因，进一步有时还包括存在约300拷贝以上的基因。高表达基因已知大多为所谓的看家基因或当家基因(House Holding gene)。看家基因无论什么细胞都恒定地进行表达，编码细胞生存所必需的蛋白(与结构蛋白、能量代谢系统的酶、蛋白质合成、DNA复制、细胞分裂等机制相关的基因等)的基因占大多数。

具体来说，已知有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、核糖体蛋白质、组蛋白、磷脂酶、转铁蛋白受体、HPRT1、RNA合成酶等的基因。可选择这些的看家基因作为目的基因。使用特定的细胞时，该细胞中也可能存在高表达的特异性基因，根据细胞不同，高表达基因的数量、种类也不同。作为这样的在特定细胞中特异性高表达的基因，可列举出例如肝脏细胞中的白蛋白、主要尿蛋白(Major Urinary Protein)的基因等。这些高表达基因可利用有关现有的基因的公开数据库而筛选出。例如，通过利用人、鼠的各组织的表达基因数据库Bodymap(http://bodymap.ims，u-tokyo.ac.jp)而获得每个组织中高表达基因的信息。此外，在现有数据库中没有信息时，通过EST解析法、SAGE法、DNA阵列法等获得基因的表达信息的方法，从而能够获知所使用的mRNA样品中的基因表达量。基于这些数据，可以制作对每个基因表达量进行排序的列表，筛选出应予除去的高表达基因候选者。作为对象的目的基因大多是为2种以上的多个。例如，可以根据基于上述数据库的信息，按照表达量多的顺序在2～10个、2～50个、2～100个、2～数百个、2～1000个、2～数千个或更多的数量的范围内选择目的基因。

根据本发明的方法，能够制备降低了高表达基因含有率的cDNA文库。也即，能够制备提高了每个细胞中的拷贝数为约12,000拷贝以下的基因，优选每个细胞中的拷贝数为约300拷贝以下的基因的含有率的cDNA文库。

结合到目的基因的mRNA的探针为具有如下特性的探针：封闭逆转录酶沿该mRNA链向5’末端方向合成的第一链cDNA的延伸。

该探针具有下述特征。

(1)基本结构

该探针的基本结构如下：其为具有与目的基因的mRNA序列的部分序列互补的序列的寡核苷酸，其3’末端被修饰为无法作为由逆转录酶的延伸反应的起始点。例如，具有缺少羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)或3’末端碱基的羟基与生物素等化合物结合的结构。

(2)结合的位置

与探针互补结合的目的基因的mRNA的碱基序列可基于由作为对象的基因序列的实际数据或公开数据库而提供的碱基序列信息来设计。此时，已知通过启动子的不同、剪接的不同、多聚(A)添加位点的不同等，由一个基因座会生成多种转录产物变体，因而，优选将探针的结合位点设定为各变体间共有的区域。

(3)互补链碱基序列的碱基长度

互补链碱基序列的碱基长度只要是能稳定地与目的基因的mRNA结合的长度，就没有特别地限定，为20～50碱基，优选为20～40碱基，更优选为20～35碱基。

(4)非天然型核酸的导入

非天然型核酸是指具有天然核酸所没有的结构的核酸，具有天然所不存在的结构的碱基。本发明中，将向探针中导入一个或多个天然核酸中所不存在的碱基的情况称为导入非天然型核酸。本发明的探针为含有非天然型核酸的寡核苷酸。

向探针中导入非天然型核酸时，优选将该探针的Tm值设定为比与作为目标序列的部分序列互补的且由天然型核酸构成的碱基序列的Tm值高2℃以上。此外，Tm值优选为更高。此外，探针的Tm值必须为高于工序(ii)的合成第一链cDNA的温度。由天然型核酸构成的碱基序列的Tm值可通过公知的方法计算。通过如此地设计探针，探针一旦与目的基因的mRNA退火后，由于探针不易分离，因而延伸反应的抑制效果变大。作为非天然型核酸，只要是与mRNA互补结合的核酸，就可以为任何核酸，优选使用肽核酸(Polyamide Nucleic Acid)、锁核酸(Locked Nucleic Acid)、交联核酸(Bridged Nucleic Acid、BNA)等。这里，肽核酸是指含有中性酰胺主链键的DNA类似物(Nielsen 等，Science 254：1497，1991等)。锁核酸是指呋喃糖环的2’和4’位结合有O-亚甲基(氧代LNA)、S-亚甲基(硫代LNA)、或NH₂-亚甲基成分(氨基化LNA)的二环核酸类似物。交联核酸是指将天然核酸分子进行交联结构化的人工合成核酸(日本特开平10-195098号公报等)。利用锁核酸(Locked Nucleic Acid)时，可参照Niels Tolstrup等的报告，预测天然型和非天然型混合时的Tm值(Niels Tolstrup，et al.，Nucleic Acid Research，2003，31，3758-3762)。导入非天然型核酸时，优选从该探针的5’末端起的2个以上碱基为非天然型核酸，更优选3个以上碱基为非天然型核酸。此外，优选导入的非天然型核酸为连续的。虽然导入的非天然型核酸数没有上限，但是优选为10个以下、更优选为5个以下。

由这些天然型和非天然型构成的探针可通过常规方法进行化学合成。使用的该探针可以以通常的纯化度来利用。

在作为对象的目的基因存在多个的情况下，可使用多个探针与全部目的基因相对应。使用的探针总数至少与作为对象的目的基因的种类数相同，可以使用相对于一个目的基因以部分序列位置不同的多个探针。

按照图1说明本发明的工序。

工序(i)中，使含有目的基因的mRNA(A)、非目的基因mRNA(B)的样品RNA与和目的基因的mRNA(A)结合的探针(C)、以及具有寡dT的双链DNA引物(D)退火。由此，生成了结合有该探针(C)和双链DNA引物(D)的目的基因的mRNA(E)和结合有双链DNA引物(D)的非目的基因的mRNA(F)。该样品RNA量即使不足1μg也能够合成cDNA，但优选使用1μg以上为佳。目的基因可使用一种或2种以上，因而需要根据目的基因的数量制备必要数量的具有上述特征的探针(C)。该探针(C)的使用量优选为mRNA(A)、(B)的50～100倍量(摩尔比)，但没有特别地限定。此外，构成上述双链DNA引物(D)中引物序列的连续的dT的数量优选为30～70个。双链DNA引物(D)没有特别地限定，可以为含有复制原点、或复制原点和cDNA表达用启动子的引物。根据该cDNA的使用目的，可以预先对双链DNA引物导入限制性内切酶位点。退火的温度可基于探针(C)的Tm值来确定，要低于探针(C)的Tm值。

探针的设计、退火条件可根据目的基因的种类而适当设定。

工序(ii)中，使逆转录酶作用于结合有探针(C)和双链DNA引物(D)的目的基因的mRNA(E)和结合有双链DNA引物(D)的非目的基因的mRNA(F)，由mRNA的3’末端沿5’末端的方向合成互补的第一链cDNA。作为逆转录酶优选为失去内源性的RNA酶H活性的酶。结合有探针(C)和双链DNA引物(D)的目的基因的mRNA(E)的情况，第一链cDNA的延伸由于在探针之前停止，因而成为未到达mRNA的5’端的不完整的mRNA/DNA异源双链(G)。另一方面，由结合有双链DNA引物(D)的非目的基因的mRNA(F)完整地合成出到5’末端为止的互补链DNA的mRNA/DNA异源双链(H)。因而，合成了仅来自于非目的基因的mRNA的第一链cDNA。在工序(ii)中形成了mRNA/cDNA异源双链和双链DNA引物的连接体。该连接体中，mRNA/cDNA异源双链的cDNA链的一端与双链DNA引物的单侧链的一端连接。此外，该工序(ii)中生成的mRNA/cDNA异源双链的cDNA为与具有帽状结构的mRNA互补、且3’端添加有dC或5’-dC(dA)n-3’的帽状连续cDNA、或不具有帽状结构的mRNA来源的帽状不连续cDNA。

工序(ii’)中，通过限制性内切酶切断将与mRNA/DNA异源双链连接的双链DNA引物的另一端进行平滑末端化，优选成为5’突出末端。此时，需要双链DNA引物的末端区域预先具备限制性内切酶位点。另外，虽然可以省略该工序，但通过实施该工序，能够大幅度地降低了cDNA文库中所含的仅由载体构成的背景。

工序(iii)中，通过连接酶，使平滑末端化或5’突出末端化双链DNA引物的另一端后的mRNA/DNA异源双链连接双链DNA引物环状化。作为连接酶可使用各种DNA连接酶或RNA连接酶，但优选使用T4RNA连接酶。将第一链cDNA延伸至mRNA的5’端的完整的非目的基因的mRNA/DNA异源双链(H)通过连接酶而环状化，而第一链cDNA的延伸在中途停止的不完整的目的基因的mRNA/DNA异源双链(G)则不进行环状化。

工序(iv)中，在进行了环状化的非目的基因的mRNA/DNA异源双链(H)中，通过RNA酶H将mRNA链分解，进而通过DNA聚合酶和DNA连接酶将该RNA链置换为DNA链。由此，合成了非目的基因的cDNA(J)。

双链DNA引物(D)只要是为含有复制原点和耐药性基因的引物，则作为工序(v)，可以转化大肠杆菌等，通过in vivo反应而将RNA链置换为DNA链。

也可将获得的非目的基因的双链cDNA克隆到载体中。例如，在双链DNA部分所具有的限制性内切酶位点切断后，插入到质粒载体、噬菌体载体等中。此时，通过使用载体引物作为双链DNA引物，从而可省略其它的插入载体的工序。载体引物，例如可通过将环状载体DNA在适当的克隆位点限制性切断，在其3’端连接与mRNA的一部分序列互补的引物序列而得到3’突出末端，来制备。

通过上述制备cDNA文库的方法而获得的cDNA文库，降低了目的基因来源的cDNA克隆含有率。对于各个目的基因来源的cDNA克隆含有率而言，目的基因的cDNA的克隆数与总cDNA的克隆数之比为2％以下，优选为1％以下。此外，相对于添加了针对目的基因的探针时的目的基因克隆数的减少率为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上。目的基因为高表达基因时，所述cDNA文库主要含有低表达基因来源的cDNA。另外，该cDNA文库以60％以上、优选75％以上、更优选90％以上、最优选95％以上这样极高的概率保持着含有帽状连接cDNA的克隆。

用于制备cDNA文库的试剂盒含有与目的基因进行退火的本发明的探针、以及用于合成其它cDNA的试剂类。作为用于合成cDNA的试剂类可举出双链DNA引物、逆转录酶、T4RNA连接酶等。

实施例

下面通过实施例具体说明本发明。本发明不受这些实施例的限定。此外，有关DNA重组的基本操作和酶反应按照文献(Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)进行。限制性内切酶和各种修饰酶在没有特别说明时，均使用宝酒造公司的制品。各酶反应的缓冲液组成、以及反应条件按照制品所附的说明书。

实施例1

由探针结合来抑制cDNA延伸反应

(1)目的基因的确定

为了以容易确认实验效果的表达量多的基因作为目的基因，进行了以下实验。使用从雄性鼠和雌性鼠的肝脏取得的总RNA各10μg、pGCAP10载体引物(国际公开第WO2004/087916号小册子)300ng，进行cDNA合成，取得了cDNA克隆。制备方法按照国际公开第WO2004/087916号小册子的记载。解析了取得的cDNA克隆的5’端碱基序列。对能测定序列的雄性肝脏来源的3,217克隆、雌性肝脏来源的2,325克隆，用GenBank的核酸数据库进行BLAST检索。其结果是，取得的雄性肝脏来源的cDNA克隆中重复度最高的基因是主要尿蛋白2(MUP2)基因，为213克隆(6.6％)；雌性肝脏来源的cDNA克隆中是白蛋白1(Alb1)基因，为174克隆(7.5％)(图2)。由这些结果，将目的基因确定为Alb1基因和MUP 2基因。

(2)mRNA的制备

在pGCAP10载体的cDNA克隆位点的上游存在T7RNA聚合酶启动子，此外下游存在NotI位点。因此，通过Not I将取得的Alb1基因、MUP2基因的cDNA克隆消化成直链状后，将其作为模板，使用利用T7RNA聚合酶的体外转录试剂盒(Ambion公司制)制备了mRNA。

(3)探针的设计

设计了一种用于中途终止cDNA合成反应即逆转录反应的探针。

作为探针的序列采用了目的基因mRNA的翻译区域的序列。此外，在探针的序列中配置了作为非天然型核酸的交联核酸(Bridged Nucleic Acid、BNA)。但是，作为终止逆转录反应以及其它延伸反应的用途，由于没有使用BNA、PNA等特殊核酸的实施例或详细信息，因此研究时对BNA的个数在1～5个的范围内进行了改变。此外，将3’末端用生物素进行了修饰从而使得探针无法作为延伸反应的引物而发挥作用。设计的探针的序列如图3所示。图3中的序列中，小写的字母表示交联核酸。Alb1-0、Mup-0所表示的序列为天然型核酸。序列表的序列号1、2和3表示Alb1-0、Mup2-0和Mup2-1的序列。此外，委托株式会社基因设计(Genedesign Corporation)合成探针。

(4)反应抑制效果的验证

研究了使用上述(3)中制备的探针来抑制逆转录反应的反应效果。以Alb1mRNA为模板时，添加了具有Alb1名称的探针，以MUP2mRNA为模板时，添加了具有MUP2名称的探针，分别进行了cDNA合成。对于反应溶液而言，准备了将mRNA 500ng、多聚dT20引物100pmol、dNTP 10nmol、所述(3)探针100pmol混合而成的共计13μl的溶液。作为对照，准备了不含所述(3)探针的反应溶液。将该反应溶液在65℃保温5分钟，在冰上迅速冷却2分钟，添加Super Script II RNA酶H-逆转录酶(Invitrogen Corporation制)200U、其附带的反应缓冲液4μl、DTT 100nmol、核糖核酸酶抑制剂40U，反应液量为20μl。然后，在42℃下反应1小时合成了第一链cDNA。用苯酚对反应液进行提取，通过乙醇沉淀回收了mRNA/cDNA异源双链，溶解于含有RNA酶A的水10μl中，将mRNA分解，通过琼脂糖凝胶电泳确认出各反应液中的cDNA的链长。其结果是，与对照相比，对于Alb1-1探针、Alb1-2探针、Mup 2-1，没有看到逆转录反应的终止。然而，Alb1-5探针看到了约88％的cDNA合成量的减少，Alb1-4探针看到了约66％的cDNA合成量的减少，Alb1-3探针看到了约25％的cDNA合成量的减少，Mup2-3探针、Mup2-2探针看到了约50％的cDNA合成量的减少。该实验结果表明，就用于抑制逆转录反应所需要的、含在探针内的BNA的配置和数量的条件而言，在富含GC序列时，连续3个以上碱基是有效的。此外，认为由于BNA中AT较多的MUP2探针与Alb1探针相比，效果较小，因此需要研究在所有序列中都能获得同样效果的条件。

(5)反应抑制效果的优化

使用Alb1-5的探针，研究了抑制Alb1 mRNA的cDNA合成的条件。对探针的使用量、退火温度、退火时间进行了研究。反应是在前述的反应体系中仅改变了探针的使用量。此外，就退火温度而言，添加了所附带的反应缓冲液4μl、DTT 100nmol、核糖核酸酶抑制剂40U，使反应液量为19μl，在42℃、57℃下、从30分钟到2小时进行保温，迅速冷却后，加入SuperScript II RNA酶H-逆转录酶(Invitrogen Corporation制)200U，在42℃反应1小时，合成了cDNA。检测方法与前述的(4)同样进行。其结果可知，探针使用量为200pmol、退火温度为57℃、退火时间为2小时时效果最好，得到了95％以上的反应抑制效果。然而，考虑到RNA的稳定性和未结合探针的量等，作为获得90％以上的反应抑制效果的条件判断为：(i)探针使用量50～100pmol、(ii)退火温度57℃、(iii)退火时间30分钟，这3个条件为最适。

下面，使用前述(4)的实验中没有获得Alb1-5探针那样效果的Mup2-3探针、Mup2-2探针，在上述最适条件下研究反应抑制效果。其结果为，Mup2-3探针获得了90％以上的反应抑制效果。然而，Mup2-2探针为与上次同样的50％左右的的反应抑制效果。这些结果表明，就在由本实验中所设定的最适条件下的反应抑制效果而言，在使用连续5个BNA个数的探针时，不论序列如何，均可看到90％以上的抑制。此外，本反应抑制效果优选使用比由天然型核酸制备的探针的Tm值(ΔTm)高2度以上、且由5’端起具有连续2个以上非天然型核酸的探针，此外，ΔTm越高则反应抑制效果越好。

实施例2

降低了高表达基因含有率的cDNA文库的制备

(1)第一链cDNA合成

使用上述探针，由总RNA进行cDNA合成。使用的探针为Alb1-5、Mup2-3。将由雄性鼠的肝脏取得的总RNA各10μg、pGCAP10载体引物(日本特开平4-108385号公报)150ng、dNTP 25nmol、探针100pmol混合，制备共计8μl的混合液。将该混合溶液在65℃下加热5分种后，用冰冷却2分钟。加入SuperScript II RNA酶H-逆转录酶(Invitrogen Corporation制)的附带缓冲液4μl，在57℃下保温30分钟。然后，用冰冷却2分钟，混和DTT 100nmol、核糖核酸酶抑制剂40U、SuperScript II RNA酶H-逆转录酶(Invitrogen Corporation制)200U，将总量调整为20μl。将该混合溶液在42℃反应1小时，合成了第一链cDNA。用苯酚提取反应液后，通过乙醇沉淀，回收mRNA/cDNA异源双链和载体引物的连接体，将其溶解于80μl水。

(2)自我连接(Self-Ligation)

在mRNA/cDNA异源双链和载体引物的连接体溶液80μl中加入10×H缓冲液(宝酒造)和限制性内切酶EcoRI(宝酒造)50U，共计为100μl，在37℃下反应1小时。用苯酚提取该溶液后，通过乙醇沉淀，回收限制性内切酶处理后的mRNA/cDNA异源双链和载体引物的连接体，将其溶解于24μl水。将该溶液与反应液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM 2-巯基乙醇、0.5mM ATP、2mM DTT)混合，添加120U的T4RNA连接酶(宝酒造)，在20℃反应16小时，使mRNA/cDNA异源双链和载体引物的EcoR I末端连接而环状化(自我连接反应)。用苯酚提取反应液后，通过乙醇沉淀，回收自我连接产物，将其溶解于50μl水中，作为cDNA载体溶液。

(3)大肠杆菌的转化

将制备的cDNA载体溶液1μl与DH10B电促细胞(Invitrogen Corporation制)20μl混合，进行由电穿孔法的转化。电穿孔使用MicroP ulser(バイオラツド公司制)进行。将获得的转化体悬浮于SOC培养基中后，接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，在35℃培养16～18小时，获得cDNA克隆的转化大肠杆菌。

(4)由杂交计算的含有率

制备了下述4种文库。

C：不添加探针的文库(C)

Alb：添加了探针Alb1-5的文库(Alb)

MUP：添加了探针Mup2-3的文库(MUP)

W：添加了探针Alb1-5和Mup2-3的文库(W)

为了求出制备的cDNA文库中所含的Alb1基因(GenBank登录号NP_033784)和MUP 2基因(GenBank登录号NP_032673)的含有率，从各文库中取出约4000克隆，实施了菌落杂交。

杂交用DIG DNA标记探针按如下制备。通过用Bst XI、Not I限制性内切酶消化Alb1基因内，从而生成1.1kbp的片段。此外，通过用Avr II、Ava II限制性内切酶消化MUP2基因内，从而生成0.7kbp的片段。将这些片段琼脂糖凝胶电泳后，切取，通过PCR扩增后，通由DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche Applied Science)制备DIG DNA标记探针。接着，将约4000个菌落从各文库转移到Hybond N+尼龙膜(安玛西亚)，用碱固定后，进行杂交。杂交以及检测使用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche Applied Science)，按照操作指南进行。杂交在温度42℃下进行。

所检测出的克隆数和含有率如图4所示。就含有率而言，Alb1基因在Alb文库中从5.6％降至1.0％，在W文库中也降至1.0％。因此，减少率均为82％。此外，MUP2基因在MUP文库中从9.9％降至3.1％，在W文库中降至3.2％。因此，减少率均为约70％。这些结果表明，由探针的添加所带来的降低效果可期待降低70％以上。此外，对于W文库，即使添加2种探针，各基因获得了相同比率的降低效果。

(5)由5’端碱基序列解析的含有率的计算

Mup2基因碱基序列的结构基因区域与其它的Mup基因(Mup1、Mup3)有80％以上的同源性。因此，利用杂交进行检测不仅能检测Mup 2基因，而且能检测整个Mup群。因此，为了求出更准确的含有率，对C和W解析了约1000克隆的碱基序列，求出了克隆数、含有率、减少率(图5)。其结果是，Alb1、Mup2的降低率为87％。

以上的由杂交以及碱基序列解析而算出的含有率的结果，实际验证了：通过添加具有本发明探针应满足的条件的探针，来制备使用了双链DNA引物的cDNA文库，从而降低了该探针所对应的克隆含有率的80％以上，即使添加多个探针也能获得降低效果。

本说明书中引用的所有出版物、专利以及专利申请均以参考的形式全部引入本说明书中。

序列表自由文本(Sequence Listing Free Text)

序列号1～3：合成