DAPT

摘要： 目的:探讨芦丁对人结肠癌(CRC)SW480细胞凋亡的影响,阐明芦丁在CRC治疗中的作用及其可能的分子机制。方法:毒性与基因比较数据库(CTD)和GeneCards数据库预测与芦丁相关的交集mRNA,基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库预测交集mRNA的生物学功能及作用通路,采用String数据库寻找与Notch-1相关作用蛋白;以人CRC SW480细胞作为研究对象,分别给予0.1、1.0和10.0μmol·L^(-1)γ-分泌酶抑制剂DAPT初步筛选,进而给予1、2、4、8和10μmol·L^(-1)DAPT干预,筛选出芦丁与DAPT的最适给药浓度。实验分为空白对照组、芦丁组(22μmol·L^(-1))、DAPT组(1μmol·L^(-1))和芦丁+DAPT组(22μmol·L^(-1)芦丁+1μmol·L^(-1)DAPT);MTT法检测SW480细胞增殖活性,Hoechst33258核染色观察各组细胞凋亡形态,流式细胞术检测各组SW480细胞凋亡率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中Notch-1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中,Notch-1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(caspase-9)、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平。结果:CTD和GeneCards数据库共有芦丁的34个交集mRNA;GO和KEGG数据库预测出交集mRNA与CRC细胞凋亡过程相关;String数据库中与Notch-1相关蛋白16个[相互作用分数(score)>0.42];芦丁与DAPT的最适给药浓度分别为22μmol·L^(-1)和1μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,芦丁组、DAPT组和芦丁+DAPT组细胞凋亡率明显升高(P0.05)。与芦丁组和DAPT组比较,芦丁+DAPT组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),caspase-3、caspase-9和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:生物信息学分析及实验研究结果均表明芦丁能促进CRC细胞凋亡,这一作用可能是通过靶向调控Notch-1调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路来实现的。

摘要： 目的探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT对尿酸诱导大鼠肾脏损伤中的作用及其机制。方法21只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(control,n=7)、高尿酸模型组(OA+UA,n=7)、DAPT治疗组(OA+UA+DAPT,n=7)。OA+UA组予2%氧嗪酸2.5 mL/100 g灌胃,3次/d,同时予0.1 mmol/L尿酸饮水,OA+UA+DAPT组在造模的同时每天予γ-分泌酶抑制剂DAPT500μg/100 g腹腔注射。对照组给予正常食物,腹腔注射等量生理盐水,模型建立8周时处死大鼠。用HE、Masson染色分析肾脏病理形态学变化,qRT-PCR、Western blot检测Notch信号通路Notch1/Jagged1/Hes1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和a平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)的mRNA和蛋白表达水平,并用免疫组化观察上述指标在大鼠肾脏的定位。结果与对照组相比,OA+UA组HE染色发现部分肾小管上皮细胞肿胀、脂肪变性、部分肾小管上皮细胞脱落,管腔扩张变形,部分肾小管萎缩,可见褐色针状放射状尿酸盐结晶。Masson染色肾小管间质可见明显波浪状的胶原纤维呈亮绿色沉积。Notch1/Jagged1/Hes1、TGF-β1和α-SMA表达水平明显增加。DAPT治疗后大鼠肾脏病理损伤较模型组的改变减轻,肾脏间质纤维化减少,Notch1/Jagged1/Hes1表达水平下调,同时TGF-β1和α-SMA表达减少。结论Notch信号通路抑制剂DAPT可以延缓高尿酸引起的大鼠慢性肾病损伤。

摘要： 目的 探究γ-分泌酶抑制剂DAPT对人骨肉瘤143B细胞和MG63细胞迁移的影响.方法 首先采用免疫荧光和免疫组化分别检测MG63细胞、143B细胞和人骨肉瘤体内肺转移临床标本Notch1的表达情况,再用DAPT和Notch通路的激动剂Jagged1处理143B细胞和MG63细胞,分别用划痕试验和Transwell迁移实验观察细胞迁移变化,最后通过裸鼠体内实验检测DAPT对MG63细胞体内转移侵袭能力的影响.结果 DAPT能够明显抑制143B细胞和MG63细胞划痕愈合能力以及跨膜迁移能力,MG63细胞的体内肺部转移瘤也在DAPT的作用下明显减小.结论 DAPT可以抑制143B细胞和MG63细胞的体外迁移以及体内转移侵袭能力.

摘要： 目的探讨Notch信号通路抑制剂DAPT对白血病干细胞的作用。方法分离初诊AL患者骨髓中单个核细胞,根据MICM 诊断分型将其分为急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML),分别与Notch信号通路阻滞剂DAPT共同作用一段时间后,观察细胞形态和采用流式细胞术方法检测LSCs细胞表面CD34、CD38、CD123、CD14的表达水平。结果Notch信号通路抑制剂DAPT使ALL的白血病干细胞的分化率和增殖抑制率明显增高(P0.05)。结论Notch信号通路抑制剂在ALL白血病干细胞的分化和增殖中起到重要的作用,而对AML无明显影响。

摘要： 目的 探讨缺氧后小胶质细胞Notch信号通路是否激活,及其对IL-1 β表达的影响.方法 将BV-2小胶质细胞分为对照组、缺氧无糖培养组(oxygen glucose deprivation,OGD组)、及缺氧无糖培养+10 μmol/L DAPT组(DAPT组);对照组细胞正常培养,OGD组、DAPT组缺氧培养4h(含3％02,5％CO2,92％N2培养箱中培养)后在正常培养箱中复氧24 h.先用CCK8分析10 μmol/L DAPT对BV-2小胶质细胞活性的影响;Western blot检测各组BV-2小胶质细胞中活化的Notch信号通路下游蛋白NICD的表达,以及免疫荧光法、RT-PCR、Western blot检测各组BV-2小胶质细胞IL-1 β的表达.数据采用单因素方差分析,用LSD-t法进行组间两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 CCK8检测OGD组及DAPT组的OD值分别为:0.269±0.013、0.265 ± 0.025(P＞0.05);表明10 μmol/L DAPT 对BV-2小胶质细胞活性无影响.Western blot 提示:与对照组比较,OGD组与DAPT组BV-2小胶质细胞NICD蛋白表达明显增加;与OGD组比较,DAPT抑制Notch信号通路后BV-2小胶质细胞NICD蛋白表达明显减少(对照组:0.632 ± 0.065,OGD组:1.276 ± 0.049,DAPT组:0.938 ± 0.049,P＜0.05).免疫荧光提示:对照组BV-2小胶质细胞少量表达IL-1 β;OGD组与DAPT组BV-2小胶质细胞IL-1 β的表达明显增加;与OGD组比较,DAPT组BV-2小胶质细胞IL-1β的表达明显减少.RT-PCR提示:与对照组比较,OGD组与DAPT组BV-2小胶质细胞IL-1 β mRNA表达明显增加;与OGD组比较,DAPT组BV-2小胶质细胞IL-1 β mRNA 表达明显减少(对照组:1.000±0.173,OGD 组:2.741 ±0.207,DAPT组:1.762 ±0.177,P＜0.05).Western blot提示:与对照组比较,OGD组与DAPT组BV-2小胶质细胞IL-lβ蛋白表达明显增加;与OGD组比较,DAPT组BV-2小胶质细胞IL-lβ蛋白表达明显减少(对照组:0.422 ±0.030,OGD 组:1.236 ±0.143,DAPT 组:0.730 ± 0.047,P<0.05).结论 缺氧可激活小胶质细胞Notch信号通路,抑制Notch信号通路可减少缺氧小胶质细胞IL-1 β的表达.

摘要： 目的:研究Notch信号通路在长春新碱(vincristine,VCR)诱导大鼠神经病理性疼痛中的作用.方法:大鼠鞘内置管并筛选出合格SD大鼠40只,采用随机区组的方法分为4组(n=10):对照组(control)、长春新碱致化疗痛模型组(VCR)、DAPT多次给药+VCR组(DAPT(8)+VCR)、DAPT单次给药+VCR组(DAPT(1)+VCR).隔日腹腔注射长春新碱(125μg/kg)建立化疗痛模型,Notch信号通路抑制剂DAPT从建模前1 d起鞘内注射(50μg/μl),其它各组注射生理盐水.测痛仪测定大鼠痛阈值;分子生物学技术检测脊髓背角NICD蛋白、Hes1 mRNA表达.结果:与对照组比较,VCR组大鼠痛阈值显著降低(P<0.01),NICD、Hes1 mRNA表达显著升高(P<0.01);与VCR组比较,DAPT多次给药+VCR组、DAPT单次给药+VCR组大鼠痛阈值均升高,NICD、Hes1 mRNA表达显著降低(P<0.05 or P<0.01).结论:Notch信号通路的活化可能参与了长春新碱诱导的神经病理性疼痛的发生、发展;抑制其活化能有效缓解大鼠痛觉过敏反应.

摘要： 目的 探讨卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ-subunit,FSHβ)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及可能的机制.方法 利用细胞化学染色方法检测处理因素(重组腺病毒或 γ 促分泌酶抑制剂DAPT)作用于间充质干细胞5 d后细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色的变化.通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)检测BMP9 mRNA、FSHβmRNA和Notch信号通路靶基因(Hey1)mRNA的表达水平.利用茜素红S(alizarin red S,ARS)染色检测腺病毒感染间充质干细胞21 d后细胞中钙盐的沉积情况.结果 FSHβ处理组ALP表达较GFP对照组无明显改变,BMP9处理组ALP表达较GFP对照组明显增加,而BMP9与FSHβ联合处理组ALP表达较BMP9处理组显著增加.另外,BMP9处理组晚期成骨标志物钙盐结节、Notch信号靶基因Hey1 mRNA表达水平较GFP对照组显著增加(P<0.01),而BMP9与FSHβ联合处理组较BMP9处理组表达显著增加(P<0.01).使用药物DAPT抑制Notch信号后,BMP9与DAPT联合处理组较BMP9单独处理组,ALP染色、Hey1 mRNA表达显著降低(P<0.05);且BMP9+FSHβ+DAPT联合处理组较BMP9+FSHβ联合处理组ALP染色、Hey1 mRNA表达也显著降低(P<0.05).结论 FSHβ可增强BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化,Notch信号通路可能在其中发挥重要作用.

摘要： 本发明提供了蛋白功能抑制剂DAPT在制备治疗垂体腺瘤的药物中的用途。通过上述技术方案，本发明能够有效地改善垂体腺瘤患者的预后。

摘要： 本发明提供了蛋白功能抑制剂DAPT在制备治疗内分泌疾病的药物中的用途。通过上述技术方案，本发明能够有效地改善由生长激素过量分泌所引起的内分泌疾病。