反转录聚合酶链反应

摘要： 目的探讨新型冠状病毒(2019-nCoV)检测前热灭活处理对核酸稳定性和检测质量的影响。方法收集2020年2—7月常熟市医学检验所接收的2019-nCoV核酸阳性标本,检验操作严格按照三级生物安全防控进行前处理分装。标本分为未灭活组(20份)和热灭活组(30份),未灭活组根据不同待检时长分为2 h组、8 h组、24 h组、48 h组,每组5份;热灭活组分为热灭活组1(56°C,30 min)、热灭活组2(56°C,60 min)、热灭活组3(56°C,2 h),每组10份。采用全自动核酸提取仪提取核酸后,以双重荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测2019-nCoV的ORF1ab基因和N基因片段。阳性将呈典型S形曲线扩增,记录并比较各组基线与曲线指数增长拐点所对应的循环数(CT值)。结果热灭活组1、热灭活组2、热灭活组3的ORF1ab基因和N基因CT值均明显高于未灭活组(ORF1ab基因:30.5±0.4、32.3±0.4、36.1±0.5比27.3±0.3,N基因:30.1±0.6、34.1±0.5、37.2±0.5比27.2±0.4,均P0.05)。热灭活组1、2、3对高浓度核酸(5×10^(5)个拷贝/mL)的CT值均明显高于未灭活组(ORF1ab基因:31.5±0.3、33.3±0.4、37.3±0.6比26.3±0.3,N基因:31.1±0.7、34.2±0.5、38.8±0.3比25.2±0.4,均P<0.05)。结论热灭活处理可影响2019-nCoV核酸的稳定性,降低ORF1ab基因和N基因的扩增CT值。48 h内待检时长对ORF1ab和N基因的扩增CT值无显著影响。2019-nCoV核酸筛查应加强三级防护,避免热灭活处理,有利于提高2019-nCoV阳性样本的筛查效率。

摘要： 为确诊福建某原种猪场保育猪群临床暴发的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),以及了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株流行情况,从该猪场采集2周龄~8周龄各周龄段保育猪临床疑似发病猪全血各5份,将各周龄段5份血样各取50μL混匀,并分别命名为2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W。利用PRRSV ORF5基因特异性引物通过RT-PCR方法进行检测,并对阳性结果进行ORF5基因序列分析。RT-PCR结果显示,2周~4周的保育猪全血中未检出PRRSV,5周~8周的保育猪全血中检出PRRSV。ORF5基因序列分析显示,5W毒株的ORF5基因与JXA1、HuN4和TJ等HP-PRRSV代表毒株同源性较高,为95.4%~95.6%,而与NADC30、VR2332、QYYZ等毒株的同源性较低,为82.7%~87.4%;6W、7W、8W毒株的ORF5基因与NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401等类NADC30 PRRSV代表毒株同源性较高,为88.9%~91.6%,而与JXA1、VR2332、QYYZ等毒株的同源性较低,为83.3%~85.6%。基于ORF5基因构建的遗传进化树显示,5W毒株属于HP-PRRSV,6W、7W、8W毒株属于类NADC30 PRRSV。结果表明,该猪场保育猪存在类NADC30和HP-PRRSV毒株混合感染。研究结果可为福建省防控PRRS提供理论依据。

摘要： 为了解四川成都市猫诺如病毒(FNoV)的感染情况,应用公开报道的3对PCR引物对127份临床采集的猫粪便样本(含临床腹泻样本71例,临床健康样本56例)进行FNoV核酸检测,并根据病毒基因片段序列构建遗传进化树.结果显示,采用猫诺如病毒特异性引物FNoV-F9/R15的检出率为9.45％(12/127),高于采用杯状病毒广泛性引物p289d-p290d(2.36％,3/127)及诺如病毒特异性引物JV12Y/13I的检出率(0.79％,1/127).检测发现在临床阳性样本中存在猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫肠道冠状病毒(FECoV)和猫星状病毒(FAstV)的混合感染.12株临床阳性样本病毒的RNA聚合酶基因序列分析显示,它们与GenBank上提交的猫诺如病毒及狮子诺如病毒处于同一分支,证实为猫诺如病毒.基于VP1基因序列分析结果显示,临床毒株间核苷酸同源性为89.0％?100.0％,氨基酸同源性为96.5％?100％,均位于诺如病毒G1V.2分支.临床毒株可分为2个分支,其中4株与日本毒株(GenBank登录号:LC389583)、美国毒株(GenBank登录号:JF781268)关系紧密;而另外3株则独立聚为1个分支,并存在共有的氨基酸变异位点.结果表明,成都市猫群中存在FNoV的流行,并与其他猫肠道病毒呈现混合感染.采用引物FNoV-F9/R15检测灵敏度高,适用于FNoV的临床检测.由于FNoV基因不断变异,存在临床发病风险,需要对其进行持续监测.

摘要： 为确诊福建某原种猪场保育猪群临床暴发的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),以及了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株流行情况,从该猪场采集2周龄?8周龄各周龄段保育猪临床疑似发病猪全血各5份,将各周龄段5份血样各取50 μL混匀,并分别命名为2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W.利用PRRSV ORF5基因特异性引物通过RT-PCR方法进行检测,并对阳性结果进行ORF5基因序列分析.RT-PCR结果显示,2周～4周的保育猪全血中未检出PRRSV,5周～8周的保育猪全血中检出PRRSV.ORF5基因序列分析显示,5W毒株的ORF5基因与JXA1、HuN4和TJ等HP-PRRSV代表毒株同源性较高,为95.4％?95.6％,而与NADC30、VR2332、QYYZ 等毒株的同源性较低,为82.7％?87.4％;6W、7W、8W毒株的ORF5基因与NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401等类NADC30 PRRSV代表毒株同源性较高,为88.9％～91.6％,而与JXA1、VR2332、QYYZ等毒株的同源性较低,为83.3％?85.6％.基于ORF5基因构建的遗传进化树显示,5W毒株属于HP-PRRSV,6W、7W、8W毒株属于类NADC30 PRRSV.结果表明,该猪场保育猪存在类NADC30和HP-PRRSV毒株混合感染.研究结果可为福建省防控PRRS提供理论依据.

摘要： 目的:观察鼠曲草提取液对N-甲基亚硝基脲(MNU)诱发膀胱肿瘤的抑制作用,并初步探讨其机制.方法:将120只SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、高、中、低剂量组4组,每组30只.经膀胱内灌注MNU(1 mg/次,1次/2周,共4次)诱发膀胱肿瘤,对照组正常饮水,高、中、低剂量组分别以高、中、低剂量鼠曲草提取液代水喂食,于第12周处死全部大鼠,取其膀胱组织标本,观察其成瘤率.TUNEL法检测肿瘤细胞调亡情况,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠膀胱癌组织存活蛋白(Survivin)表达.结果:高、中、低剂量组大鼠膀胱癌成瘤率分别为60％(18/30)、75.86％(22/29)、86.21％(25/29),而对照组大鼠膀胱癌成瘤率为100％(28/28).TUNEL法原位检测发现鼠曲草提取液可显著促进膀胱癌细胞的调亡,且与剂量相关;大鼠膀胱癌组织Survivin表达显示鼠曲草提取液可显著降低大鼠膀胱癌组织中Survivin表达.结论:鼠曲草提取液对大鼠膀胱癌形成有明显抑制作用.

摘要： 目的 探讨荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)用于GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的检测效能.方法 选取2017年5月至2020年4月该院收治的有腹泻、腹痛、呕吐症状患儿40例,采集两份粪便样本检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒,均采用荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方式,对比两种检测方式的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率.结果 常规RT-PCR对诺如病毒的检测灵敏度为82.4％(28/34),特异度3/6,阳性预测值90.3％(28/31),阴性预测值3/9,准确率77.5％(31/40).荧光定量RT-PCR对诺如病毒的检测灵敏度为100％(34/34),特异度5/6,阳性预测值97.1％(34/35),阴性预测值5/5,准确率97.5％(39/40).结论 荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒均有一定的检测效果,但前者更准确.

摘要： 为建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)G1型/G2型感染的RT-PCR方法,基于PEDV的S基因和E基因序列分别设计了PEDV的分型引物和鉴别引物,经过敏感性试验、重复性试验等一系列反应条件的优化,成功建立了鉴别PEDV G1/G2型感染的双重RT-PCR方法;通过目的片段的数量来判断PEDV的感染类型,其中,PEDV G1型感染可扩增得到一条目的片段(249 bp),G2型感染扩增得到两条目的片段(840 bp和249 bp).利用该方法对采自广西不同地区的92份临床样品进行检测,结果显示,阳性样品55份,其中,G2型样品53份,G1型样品2份.结果表明该方法操作简易,具有良好的敏感性和特异性,能快速鉴别PEDV G1/G2型的感染.

摘要： 目的 探讨乳腺癌中脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase,SyK)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)表达的相关性及其与乳腺癌患者预后的关系.方法 采用实时PCR方法分别检测120例乳腺癌组织、100例正常乳腺组织、100例纤维腺瘤组织之间的SyK和HGF基因表达,分析乳腺癌组织中二者的表达水平与临床病理学特征的关系,并对其表达的相关性以及与乳腺癌患者预后的关系进行了统计分析.结果 SyK、HGF mRNA的表达在乳腺癌组织和正常乳腺组织及纤维腺瘤组织之间比较,差异有统计学意义(P＜0.01);而二者表达在其他两组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).SyK、HGFmRNA表达与乳腺癌的临床分期、脉管侵犯相关(P＜0.05),但与年龄、肿块直径无关(P＞0.05).120例乳腺癌患者的随访结果为术后5年内死亡人数为8例,占6.67％ (8/120),生存中位数时间为47个月,采用Kapla-Meier法对120例乳腺癌患者分为两组,即比较组与预后组,结果显示对两组生存曲线整体比较的Log Rank检验结果为P=0.009,Breslow检验结果为P=0.018.按照Log Rank检验的结果,可以认为两组表达对患者的生存率有差异,预后组与生存状态呈负相关(r=-0.202,P＜0.05).结论 SyK、HGF参与乳腺癌侵袭和转移中的作用,SyK缺失或HGF过表达提示患者预后不良,可作为乳腺癌预后判断的指标.

摘要： 目的通过检测服用补肾阳中药和补肾阴中药后的雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体(estrogen receptor β,ER β)mRNA及蛋白,从分子水平探讨补肾中药对雄性大鼠神经系统雌激素受体的影响.方法SD雄性大鼠,分为A、B,C三组,A、B分别给予补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子持续灌胃14 d,C组作为空白对照,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测雌激素受体ER β mRNA表达量,免疫组化染色检测ER β蛋白的分布及表达.结果A、B组杏仁核,皮质顶叶雌激素受体ER β mRNA表达量均显著高于C组(P<0.01,0.05),A组ER β mRNA表达量增高显著高于B组(P<0.01);A组和B组ER β蛋白免疫组化阳性细胞均显著高于C组(P<0.01,0.05),A组皮质顶叶ERβ蛋白阳性细胞高于B组(P<0.01).结论补肾中药对ER β基因及蛋白具有调节作用.

摘要： 目的：通过检测服用补肾阳中药和补肾阴中药后的雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体β亚型(estrogenreceptorβ，ERβ)mRNA及蛋白，探讨补肾中药对雄性大鼠神经系统雌激素受体的影响。方法：SD雄性大鼠，分为A、B、C三组，A、B分别给予补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子持续灌胃14 d，C组作为空白对照;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测雌激素受体ERβmRNA表达量，免疫组化染色检测ERβ蛋白的分布及表达。结果：A组杏仁核、皮质顶叶雌激素受体ERβmRNA表达量显著高于B组和C组(P<0．01)，B组仅在杏仁核中ERβmRNA表达量高于对照组(P<0．05);A组和B组ERβ蛋白H-score积分均显著高于C组(P<0．01)，A组皮质顶叶ERβ蛋白H-score积分高于B组。结论：补肾中药对ERβ基因及蛋白具有调节作用。该作用可能与补肾中药对神经系统生长、发育、缺血损伤后再生重建等保护作用有关。

摘要： 猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的疾病.目前PRRSV的检测方法主要是RT-PCR和ELISA,但是RT-PCR存在假阳性、灵敏度低的缺点、ELISA步骤较多检测所用时间较长.本研究通过荧光定量检测PRRSV方法的建立,为猪场提供一种快速准确的检测方法.结果:(1)通过引物浓度、反应条件优化得到了荧光定量PCR检测PRRSV反应的最适体系和条件:体系:SYBR Primix Ex TaqTM 10μL，上下引物终浓度0.5μM，模板8.5μL;反应条件95°C 3min,40cycles;95°C 6s,55°C 7s,72°C 13s;(2)建立了标准曲线Ct值=-3.323*1g拷贝数+30.898,R2=0.998线性关系良好，扩增效率E=100%。(3)灵敏度检测发现，荧光定量方法最低可以检测出102copies/μL，远大于普通RT-PCR的灵敏度。本研究建立了荧光定量的方法检测PRRSV，与普通RT-PCR相比荧光定量不需进行电泳，因此减少了PCR产物污染造成假阳性的缺点;本方法可以在3h内完成，步骤较简单，比ELISA方法用时少且成本较低。

摘要： 猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的疾病.目前PRRSV的检测方法主要是RT-PCR和ELISA,但是RT-PCR存在假阳性、灵敏度低的缺点、ELISA步骤较多检测所用时间较长.本研究通过荧光定量检测PRRSV方法的建立,为猪场提供一种快速准确的检测方法.结果:(1)通过引物浓度、反应条件优化得到了荧光定量PCR检测PRRSV反应的最适体系和条件:体系:SYBR Primix Ex TaqTM 10μL，上下引物终浓度0.5μM，模板8.5μL;反应条件95°C 3min,40cycles;95°C 6s,55°C 7s,72°C 13s;(2)建立了标准曲线Ct值=-3.323*1g拷贝数+30.898,R2=0.998线性关系良好，扩增效率E=100%。(3)灵敏度检测发现，荧光定量方法最低可以检测出102copies/μL，远大于普通RT-PCR的灵敏度。本研究建立了荧光定量的方法检测PRRSV，与普通RT-PCR相比荧光定量不需进行电泳，因此减少了PCR产物污染造成假阳性的缺点;本方法可以在3h内完成，步骤较简单，比ELISA方法用时少且成本较低。

摘要： 猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的疾病.目前PRRSV的检测方法主要是RT-PCR和ELISA,但是RT-PCR存在假阳性、灵敏度低的缺点、ELISA步骤较多检测所用时间较长.本研究通过荧光定量检测PRRSV方法的建立,为猪场提供一种快速准确的检测方法.结果:(1)通过引物浓度、反应条件优化得到了荧光定量PCR检测PRRSV反应的最适体系和条件:体系:SYBR Primix Ex TaqTM 10μL，上下引物终浓度0.5μM，模板8.5μL;反应条件95°C 3min,40cycles;95°C 6s,55°C 7s,72°C 13s;(2)建立了标准曲线Ct值=-3.323*1g拷贝数+30.898,R2=0.998线性关系良好，扩增效率E=100%。(3)灵敏度检测发现，荧光定量方法最低可以检测出102copies/μL，远大于普通RT-PCR的灵敏度。本研究建立了荧光定量的方法检测PRRSV，与普通RT-PCR相比荧光定量不需进行电泳，因此减少了PCR产物污染造成假阳性的缺点;本方法可以在3h内完成，步骤较简单，比ELISA方法用时少且成本较低。

摘要： 猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的疾病.目前PRRSV的检测方法主要是RT-PCR和ELISA,但是RT-PCR存在假阳性、灵敏度低的缺点、ELISA步骤较多检测所用时间较长.本研究通过荧光定量检测PRRSV方法的建立,为猪场提供一种快速准确的检测方法.结果:(1)通过引物浓度、反应条件优化得到了荧光定量PCR检测PRRSV反应的最适体系和条件:体系:SYBR Primix Ex TaqTM 10μL，上下引物终浓度0.5μM，模板8.5μL;反应条件95°C 3min,40cycles;95°C 6s,55°C 7s,72°C 13s;(2)建立了标准曲线Ct值=-3.323*1g拷贝数+30.898,R2=0.998线性关系良好，扩增效率E=100%。(3)灵敏度检测发现，荧光定量方法最低可以检测出102copies/μL，远大于普通RT-PCR的灵敏度。本研究建立了荧光定量的方法检测PRRSV，与普通RT-PCR相比荧光定量不需进行电泳，因此减少了PCR产物污染造成假阳性的缺点;本方法可以在3h内完成，步骤较简单，比ELISA方法用时少且成本较低。

摘要： 目的：为对四川省某猪场腹泻病病原进行分离鉴定,并进一步研究其分子生物学特性。rn 方法：本试验对四川省某猪场疑似感染PEDV的腹泻猪粪便样品进行采集;参照NCBI上登录的CV777株M基因全基因序列设计引物,用RT-PCR法初步鉴定样品阴阳性,同时克隆测定M基因序列。rn 结果：分析结果表明该株PEDV与NCBI上10个毒株推导氨基酸序列同源性均高于95％;遗传进化树分析结果显示该毒株与GDYE9遗传距离最近;用Vero细胞对病毒进行连续带毒传代,观察细胞病变,同时应用电镜技术对病毒形态进行观察;通过TCID50测定,中和试验以及核酸类型的鉴定,综合判定病毒分离成功;用分离的毒株进行乳猪回归试验,结果表明三只试验猪均出现腹泻症状.rn 结论：试验结果均表明PEDV DY株被成功分离.

摘要： 目的：为对四川省某猪场腹泻病病原进行分离鉴定,并进一步研究其分子生物学特性。rn 方法：本试验对四川省某猪场疑似感染PEDV的腹泻猪粪便样品进行采集;参照NCBI上登录的CV777株M基因全基因序列设计引物,用RT-PCR法初步鉴定样品阴阳性,同时克隆测定M基因序列。rn 结果：分析结果表明该株PEDV与NCBI上10个毒株推导氨基酸序列同源性均高于95％;遗传进化树分析结果显示该毒株与GDYE9遗传距离最近;用Vero细胞对病毒进行连续带毒传代,观察细胞病变,同时应用电镜技术对病毒形态进行观察;通过TCID50测定,中和试验以及核酸类型的鉴定,综合判定病毒分离成功;用分离的毒株进行乳猪回归试验,结果表明三只试验猪均出现腹泻症状.rn 结论：试验结果均表明PEDV DY株被成功分离.

摘要： 目的：为对四川省某猪场腹泻病病原进行分离鉴定,并进一步研究其分子生物学特性。rn 方法：本试验对四川省某猪场疑似感染PEDV的腹泻猪粪便样品进行采集;参照NCBI上登录的CV777株M基因全基因序列设计引物,用RT-PCR法初步鉴定样品阴阳性,同时克隆测定M基因序列。rn 结果：分析结果表明该株PEDV与NCBI上10个毒株推导氨基酸序列同源性均高于95％;遗传进化树分析结果显示该毒株与GDYE9遗传距离最近;用Vero细胞对病毒进行连续带毒传代,观察细胞病变,同时应用电镜技术对病毒形态进行观察;通过TCID50测定,中和试验以及核酸类型的鉴定,综合判定病毒分离成功;用分离的毒株进行乳猪回归试验,结果表明三只试验猪均出现腹泻症状.rn 结论：试验结果均表明PEDV DY株被成功分离.

摘要： 目的：为对四川省某猪场腹泻病病原进行分离鉴定,并进一步研究其分子生物学特性。rn 方法：本试验对四川省某猪场疑似感染PEDV的腹泻猪粪便样品进行采集;参照NCBI上登录的CV777株M基因全基因序列设计引物,用RT-PCR法初步鉴定样品阴阳性,同时克隆测定M基因序列。rn 结果：分析结果表明该株PEDV与NCBI上10个毒株推导氨基酸序列同源性均高于95％;遗传进化树分析结果显示该毒株与GDYE9遗传距离最近;用Vero细胞对病毒进行连续带毒传代,观察细胞病变,同时应用电镜技术对病毒形态进行观察;通过TCID50测定,中和试验以及核酸类型的鉴定,综合判定病毒分离成功;用分离的毒株进行乳猪回归试验,结果表明三只试验猪均出现腹泻症状.rn 结论：试验结果均表明PEDV DY株被成功分离.

摘要： 本发明公开了一种能鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。还公开了该试剂盒的检测方法。该方法针对猪瘟病毒NS5B基因设计5条引物，S1、S2为疫苗毒株与流行毒株外扩通用引物，S3、S4为疫苗毒株与流行毒株内扩通用引物，S5为疫苗株内扩特异性引物。经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出流行毒株感染，又能判断是否是疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围猪瘟疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。

摘要： 本发明提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

摘要： 一种单管一步三引物反转录聚合酶链式反应方法，其RT－PCR反应液含一对PCR引物和一个位置在PCR反引物下游的反转录引物，PCR引物被包埋在石蜡等固体颗粒内置于反应液中，反转录时不与反应液接触，进入扩增阶段石蜡熔化引物被释放到溶液中。同时通过设计PCR引物的解链温度大于反转录引物的解链温度、目标扩增产物的解链温度低于由PCR正引物与反转录引物形成的非目标扩增产物的解链温度、或设计反转录引物位置距PCR反引物较远等方法避免反转录引物对扩增的干扰。适用于终点法直接荧光或闭管直接荧光方法进行高速度、高通量的RNA检测。

摘要： 本发明涉及在PCR产物的末端上互补结合探针的情况下，利用抑制DNA聚合酶的5'‑瓣状内切核酸酶(FEN)活性的特性来检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。更具体地涉及将实时聚合酶链反应(real‑time PCR)中使用的探针与PCR产物末端进行互补结合的情况下，确认抑制针对探针的耐热性DNA聚合酶的5'‑瓣状内切核酸酶活性的特性，并利用其特性来使待检测的单核苷酸多态性(SNP)部位位于探针的5'‑末端部位时，根据等位基因(allele)来诱导5'‑瓣状的形成，从而可有效地检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。

摘要： 本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增等温检测方法(Reverse transcription polymerase spiral reaction，RT‑PSR)。本发明提供了一套完整的猪流行性腹泻病毒聚合酶螺旋检测方法，包括检测试剂和反应条件，根据基因保守区设计合成一对特异性引物，包括上游引物S3、下游引物S4，检测试剂包括如下组分：10×Bst Buffer反应缓冲液、dNTPs、MgSO4、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、DEPC水、显色试剂和上述引物。本发明提供的检测方法在应用时具有特异性强、灵敏性高、操作简便、成本低廉等优点。

摘要： 本发明提供一种反转录聚合酶链式反应的方法，其主要包括以下步骤：准备毛细管，将反转录反应所需的反转录酶加入毛细管中，经过预冻干燥程序，在该毛细管内制成反转录冻干反应剂，由此，在使用时可将RNA检体、缓冲液、聚合酶与引物溶液直接加入该毛细管中，与反转录冻干反应剂混合进行回溶，使反转录反应与聚合酶链式反应可一并于毛细管内进行，因而有助于提高实验流程的便利性。

摘要： 本发明提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

摘要： 本发明涉及反转录聚合酶链反应检测转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA表达的方法，该方法包括以下的步骤：1）提取总RNA；2）毛囊干细胞RNA的逆转录体系；3）聚合酶链式反应；4）琼脂糖电泳：取扩增产物6μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达的检测。

摘要： 本发明涉及反转录聚合酶链反应检测转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA表达的方法，该方法包括以下的步骤：1）提取总RNA；2）毛囊干细胞RNA的逆转录体系；3）聚合酶链式反应；4）琼脂糖电泳：取扩增产物6μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达的检测。

摘要： 本发明提供一种不需要分离DNA的反转录聚合酶链反应方法，即设计引物使以RNA为模板的RT－PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低1－25°C，以克服现有RT－PCR方法难以排除样品中的DNA对以RNA为原始模板的RT－PCR的干扰的缺陷。一方面简化甚至省略了RNA与DNA的分离步骤，另一方面由于完全克服了DNA扩增产物的干扰，可使用简单的方法来检测反转录PCR扩增产物，能在分子生物学研究和临床高通量快速诊断中普遍应用。