摘要：
目的:筛选靶向上调雌激素受体β(ERβ)转录和表达的人参皂苷单体,研究其对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响及其机制.方法:采用PGL2-ERβ和内参Renilla荧光素酶质粒Prep7-Rluc共同转染HEK293T细胞,细胞分为对照组,雌二醇组(1×10-6 mmol·L-1),人参皂苷Rb1组、Rb2组、Rd组、Rg1组、Rg2组和Rh1组(1×10-5 mmol·L-1),通过双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞双荧光素酶活性.进一步将MC3T3-E1细胞分为对照组、雌二醇组和不同浓度(1×10-6、1×10-5及1×10-4 mmol·L-1)人参皂苷Rh1组,采用Western blotting法检测各组MC3T3-E1细胞中ERβ蛋白表达水平.通过Auto Dock分子对接实验,模拟人参皂苷Rh1与ERβ蛋白分子的结合情况.MC3T3-E1细胞分为对照组、雌二醇组和不同浓度(5×10-6、1×10-5、5×10-5、1×10-4、1×10-3及5×10-3 mmol·L-1)人参皂苷Rh1组,分别作用24、48和72 h后,采用CCK-8法检测各组细胞增殖率.MC3T3-E1细胞分为对照组、雌二醇组(1×10-6 mmol·L-1)和不同浓度(1×10-5及1×10-4 mmol·L-1)人参皂苷Rh1组,配制成骨诱导液,分别诱导MC3T3-E1细胞7、14和21 d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色检测细胞中ALP和钙化结节染色面积,观察人参皂苷Rh1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.结果:双荧光素酶报告基因实验,各组HEK293T细胞中转染ERβ-PGL2质粒后,与对照组比较,1×10-5 mmol·L-1人参皂苷Rh1组细胞荧光素酶活性明显升高(P<0.05).Western blotting法检测,与对照组比较,不同浓度人参皂苷Rh1组细胞中ERβ蛋白表达水平明显升高(P<0.05),且1×10-4 mmol·L-1人参皂苷Rh1组细胞中ERβ蛋白表达水平最高.Auto Dock分析,人参皂苷Rh1可以结合在ERβ蛋白的配体结合口袋内.CCK-8实验,培养24、48和72 h后,与对照组比较,1×10-5、5×10-5、1×10-4和1×10-3 mmol·L-1人参皂苷Rh1组MC3T3-E1细胞增殖率均明显升高(P<0.01),其中72 h时1×10-4 mmol·L-1人参皂苷Rh1组细胞增殖率最高.成骨诱导分化后,与对照组比较,不同浓度人参皂苷Rh1组细胞中ALP染色面积明显增加,1×10-4 mmol·L-1人参皂苷Rh1组细胞中ALP染色面积最大,而且14 d时ALP染色面积较7 d时明显增加,具有时间和浓度依赖性;与对照组比较,不同浓度人参皂苷Rh1组细胞矿化结节茜素红染色面积明显增加.结论:人参皂苷Rh1能够明显促进成骨细胞的增殖和分化,其机制可能与其靶向上调细胞中ERβ的转录和表达有关.
