免疫沉淀

摘要： 蛋白质糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,糖基化过程的失调或紊乱与癌症、炎症性疾病、神经系统疾病等密切相关.分析和研究蛋白质糖基化的结构与功能,有望为探索疾病发生的分子机制、开发新的诊断依据和控制治疗用生物药物的质量提供重要信息.然而生物样品中糖基化蛋白质相对丰度低,样品基质复杂,故而适宜的分离技术必不可少.亲和技术具有良好的专一性和灵敏度,可有效实现蛋白质的分离富集,成为糖基化蛋白质结构与功能研究的有力工具,并在近期得到发展.本文介绍亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰分析中的应用进展.

摘要： 为阐明瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)的侵染机制,筛选与P22互作的寄主因子.采用免疫沉淀技术结合质谱分析共获得128个寄主蛋白.KEGG分析发现,所获得的寄主因子主要参与到寄主体内的碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等代谢途径中.将所获得的128个基因进行GO分析,发现筛选到的与P22蛋白相互作用的寄主蛋白分为39个功能组,分别属于生物过程、分子功能和细胞组分三大类别.在生物过程类别中光合作用、蛋白质折叠、葡萄糖代谢过程及碳代谢过程为主要功能组.在分子功能类别中,ATP结合和金属离子结合为主要功能组.在细胞组分类别中生物膜、细胞质和光系统Ⅱ氧化复合体为主要功能组.结合质谱分析结果,根据富集肽段数目和蛋白质功能筛选出8个候选寄主蛋白.KEGG数据库分析表明,8个候选寄主蛋白可能参与或涉及的代谢通路大类可以归为碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等3个代谢途径.利用酵母双杂交验证8个寄主因子与P22互作.结果表明,甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(GAPDH-A)能够与P22蛋白在酵母中互作,推测P22可能影响寄主抗性并参与寄主黄化症状的产生.筛选鉴定了与P22互作的寄主因子,为阐明P22蛋白在CCYV侵染过程中的作用机制奠定了基础.

摘要： 大肠癌(CRC)是一种死亡率高的常见肿瘤。然而,驱动大肠癌发生的分子机制尚不清楚。已知,时钟基因在肿瘤发生发展中起着重要作用。在我们目前的研究中,免疫组织化学结果显示,和癌旁正常组织相比,时钟基因TIM(编码Timeless蛋白质)在CRC组织中表达上调,通过对临床CRC患者的分析,我们发现其表达与肿瘤临床分期及CRC患者总体生存率差密切相关。功能研究表明,TIM在体内外均能促进大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。机制研究表明,TIM在上皮间质转化(EMT)中起着关键作用。免疫沉淀后质谱分析显示,肌球蛋白-9与Timeless蛋白质是结合的。

摘要： 寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.

摘要： 甲状腺素(TH)在牙鲆(Paralichthys olivaceus)变态发育过程中具有重要的调控作用,其通过与甲状腺素受体结合并在甲状腺素受体结合蛋白的共同作用下发挥生物学功能.利用免疫沉淀和质谱分析法鉴定了牙鲆甲状腺素受体β(TRβ)的结合蛋白,并采用实时荧光定量PCR技术检测了结合蛋白在牙鲆变态过程中受外源甲状腺素调控的变化.从TRβ多克隆抗体与牙鲆胚胎细胞总蛋白的免疫沉淀复合物中鉴定得到了21个牙鲆蛋白,生物信息学分析显示它们参与到多种生命活动中.对其中7个代表性蛋白的基因在出膜后第21天(21 dph)和第28天(28 dph)的牙鲆仔鱼体内的转录水平检测发现,它们的表达在外源甲状腺素处理后均表现出显著变化,其中beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、RPS15A、Slc25a5和EF1a的表达受外源甲状腺素处理显著下调,CK1截然相反,它的表达受甲状腺素处理显著上调;硫脲处理对所分析的基因则几乎都没有明显影响.本研究为进一步探究甲状腺素受体介导甲状腺素调控牙鲆变态提供了新的见解.

摘要： 目的:构建新型人源真核表达载体3*Flag-hSesn2并同时检测其在骨肉瘤细胞中的表达及定位.方法:以GST-hSesn2作为模板,利用聚合酶链反应扩增目的基因hSesn2的cDNA全长,并将其克隆到含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒酶切并测序分析鉴定,转染至MG-63骨肉瘤细胞中,提取细胞总蛋白后进行Western blot检测重组蛋白表达.此外利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测3*Flag-hSesn2在MG-63细胞系中的定位,并最终利用免疫沉淀方法纯化人源Sesn2蛋白.结果:hSesn2基因cDNA全长成功构建于含有3*Flag标签的真核表达载体中,利用Western blot检测3*Flag-hSesn2融合蛋白表达,分子量约为55kDa.3*Flag-hSesn2在MG-63骨肉瘤细胞系中主要定位于细胞质及核周,进一步成功纯化了hSesn2蛋白.结论:成功的构建了含有3*Flag标签的人源Sesn2真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hSesn2融合蛋白的表达,最终成功纯化hSesn2蛋白.其中3*Flag-hSesn2蛋白主要定位在细胞质和核周.%Objective:To construct the expression plasmid of human Sestrin2 (hSesn2)gene and identify the ex-pression and localization of hSesn2 in osteosarcoma MG - 63 cells. Methods:Human hSesn2 coding sequence was ob-tained by polymerase chain reaction (PCR)amplification and cloned into 3*Flag tag expression plasmid. After the target cDNA was identified by double enzymes digestion and sequencing,the plasmid was transiently transfected into osteosarcoma MG - 63 cell line. The expression of the recombinant plasmid in MG - 63 cells was detected by Western blot. The localization of 3*Flag - hSesn2 in MG - 63 cells was observed with laser scanning confocal microscopy. The hSesn2 protein was purified by immunoprecipitation assay. Results:Human Sesn2 plasmid containing 3*Flag tag was successfully constructed. The fragment length was identified as 1443bp by restriction enzyme digestion. The protein level of 3*Flag - hSesn2 fusion protein was detected by Western blot as a molecular weight of 55kDa and pulled down by Flag antibody. The localization of recombinant protein is in the cytoplasm and perinucleus of MG - 63 cells. Conclusion:The hSesn2 recombinant plasmid was successfully constructed. The expression of 3*Flag - hSesn2 fu-sion protein was identified and pulled down by Flag antibody,and it was localized in cytoplasm and perinucleus of MG- 63 cells.

摘要： 目的:构建新型人源真核表达载体3* Flag-hPlk3并同时检测其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达及定位.方法:以GST-hPlk3作为模板,利用聚合酶链反应扩增人源Plk3目的基因eDNA全长,并将其克隆到含有3* Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序分析鉴定,并转染至U2OS骨肉瘤细胞系中,提取细胞总蛋白进行Western blot检测.同时利用荧光共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPlk3在U2OS细胞系中的定位,进一步利用免疫沉淀方法纯化人源Plk3蛋白.结果:hPlk3基因cDNA全长成功构建于含有3* Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测3*Flag-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为74kDa.3 * Flag-hPlk3在骨肉瘤细胞系U2OS中主要定位于细胞质及核周,并成功纯化了hPlk3蛋白.结论:成功的构建了含有3* Flag标签的人源Plk3真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hPlk3融合蛋白的表达,最终成功纯化hPlk3蛋白.3*Flag-hPlk3蛋白主要定位在细胞质和核周.%Objective:To construct the expression plasmid of human Polo-like kinase 3 (hPlk3) gene and to identify the expression and localization of hPlk3 in U2OS osteosarcoma cells.Methods:GST-hPlk3 was used plasmid as a template,human Plk3 coding sequence was obtained by polymerase chain reaction (PCR) amplification and cloned into 3 * Flag expression plasmid.After the target region was identified by enzyme digestion and sequencing,the plasmid was transiently transfected into osteosarcoma U2OS cells.The expression of the recombinant plasmid in U2OS cells was detected by Western blot.The localization of 3 * Flag-hPlk3 in U2OS cells was observed with laser scanning confocal microscopy.The hPlk3 protein was purified by immunoprecipitation assay.Results:Human Plk3 coding sequence was constructed into the expressing vector 3 * Flag successfully.The length of the PCR fragment identified by restriction enzyme digestion was 1 941bp.The expression of 3 * Flag-hPlk3 fusion protein was detected by Western blot with a molecular weight of 74kDa and pulled down by Flag antibody.The localization of recombinant protein is in the cytoplasm and perinucleus of U2OS cells.Conclusion:The recombinant plasmid of hPlk3 gene was successfully constructed into eukaryotic expressing plasmid.The expression of 3 * Flag-hPlk3 fusion protein was identified and pulled down by Flag antibody.Furthermore,it was localized in cytoplasm and perinucleus.

摘要： Objective:To construct the expression plasmid of human sorbin and SH3 domain containing 1(hSesn1)gene and identify the expression and localization of hSesn1 in MG-63 osteosarcoma cells.Methods:GST-hSesn1 was used as a template,human SESN1 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction(PCR)amplification and cloned into 3*Flag empty vector.After the cloning target was identified by double enzyme digestion and sequenced,the plasmid was transiently transfected into MG-63 osteosarcoma cells.The expression of the recombinant protein in MG-63 cells was detected by Western blot assay.The localization of 3*Flag-hSesn1 in MG-63 cells was observed by laser confocal scanning microscopy.The hSesn1 protein was purified by immunoprecipitation assay.Results:hSesn1 gene was successfully constructed into the 3*Flag expressing plasmid.The expression of 3*Flag-hSesn1 fusion protein was detected by Western blot and pulled down by anti-flag antibody.The localization of fusion protein is at the cytoplasm and near nuclear membrane of MG-63 cells.Conclusion:The recombinant hSesn1 plasmid was successfully cloned into eukaryotic expressing vector,and the expression of 3*Flag-hSesn1 fusion protein was pulled down by anti-flag antibody and majorly expressed at the cytoplasm and partly nuclear.%目的:构建3*Flag-hSesn1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以GST-hSesn1为模板,利用聚合酶链反应扩增hSesn1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中.将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到MG-63骨肉瘤细胞中,提取总蛋白进行Western blot检测.进一步利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSesn1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化人源Sesn1蛋白.结果:hSesn1基因的cDNA全长成功构建到3*Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测到了含有Flag标签的人源Sesn1融合蛋白表达,且在MG-63骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化人源Sesn1蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hSesn1真核表达质粒,同时鉴定了其融合蛋白的表达,并纯化人源Sesn1蛋白.3*Flag-hSesn1蛋白主要定位在细胞质,部分定位于细胞核周.

摘要： 目的:构建3*Flag-hPlk4真核表达载体,并证实重组表达载体在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以pGEX-4T-2-hPlk4为模板,利用聚合酶链反应扩增hPlk4基因cDNA全长,并将其克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到U2OS骨肉瘤细胞中,Western blot检测重组蛋白的表达.同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hPlk4表达载体在U2OS细胞中的定位,进一步利用免疫沉淀的方法纯化人源Plk4蛋白.结果:hPlk4基因cDNA全长成功构建到3*Flag真核表达载体中,Western blot检测到含有3*Flag的人源Plk4融合蛋白表达,进一步在U2OS骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和细胞核周,并成功纯化hPlk4蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk4真核表达质粒,同时鉴定了融合蛋白的表达,并成功纯化人源Plk4蛋白.3*Flag-hPlk4蛋白主要定位在细胞质和细胞核周.%Objective:To construct the expression plasmid of human sorbin and SH3 domain containing 1(hPlk4) gene and identify expression and localization of hPlk4 in U2OS osteosarcoma cells.Methods:Using pGEX-4T-2-hPlk4 plasmid as a template,human Plk4 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction(PCR) and cloned into 3*Flag empty vector.After the target region was identified by double enzymes digestion and sequencing,the plasmid was transiently transfected into U2OS osteosarcoma cells.The 3*Flag-hPlk4 plasmid expression in U2OS cells was detected by Western blot assay.The localization of 3*Flag-hPlk4 fusion protein in U2OS cells was observed with laser scanning confocal microscopy.The hPlk4 protein was purified by immunoprecipitation assay.Results:Human Plk4 gene was successfully constructed into the 3*Flag expression vector.The expression of 3*Flag-hPlk4 fusion protein was detected by Western blot assay and pulled down by anti-flag antibody.Its localization is at the cytoplasm and perinuclear of U2OS cells.Conclusion:The 3*Flag-hPlk4 recombinant plasmid was successfully cloned into eukaryotic expression vector.The expression of 3*Flag-hPlk4 fusion protein was pulled down by anti-flag antibody and localized at the cytoplasm and perinucleus.

摘要： 蒙古羊中多脊椎个体比例达到25%，其胸椎和腰椎比普通羊多1-2枚，因而体型大，身躯长，具有优良的肉质特性和出色的产肉性能。虽然人们早己知道蒙古羊的这个解剖特征，但一直没有发现其形成的原因以及这种变异的传递规律和表达方式，至今仍未找到简便而又可靠的鉴别和选择的方法，因而无法系统选育这个有利性状。研究推断蒙古羊的多脊椎遗传变异与HomeoBox基因变异有关。这种变异具有基因组印记(genomic imprinting)遗传特征，CpG岛中胞嘧啶的甲基化是印记所必需的。本研究表明，多脊椎性状与该片段的甲基化程度显著相关，可作为鉴别蒙古羊多脊椎个体分子标记。

摘要： 本文的公开内容包括用于标记细胞中核靶缔合的DNA的系统、方法、试剂盒和组合物。一些实施方案提供了包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂的消化组合物。一些实施方案提供了包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂的缀合物。转座体可以包含转座酶(例如Tn5转座酶)、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。方法可以包括使包含与dsDNA(诸如基因组DNA(gDNA))缔合的核靶的透化的细胞与本文提供的组合物接触以产生多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)，所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段各自包含一个或两个单链突出端。

摘要： 本发明提供了一种用于通过检测来自生物样品中的微生物的耐药性基因的至少一种转录物确定微生物对于药物的耐药性的方法，该方法包括以下步骤：(i)通过化学或机械方法裂解细胞，从而获得裂解物和细胞碎片；(ii)使用特异性地结合微生物‑核糖体蛋白的抗体或其片段从该裂解物获得核糖体‑抗体复合物；(iii)通过核酸提取方法纯化与该核糖体‑抗体复合物缔和的mRNA；并且(iv)将所得的mRNA经受特异性基因检测方法，从而鉴定该生物样品的该至少一种耐药性基因转录物。所提供的方法和试剂盒允许以快速且可靠的方式确定生物样品对于抗生素的耐药性，从而使AMR的风险最小化并且允许定义所选抗生素的治疗性潜力。

摘要： 本发明公开了一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒，属于免疫沉淀技术领域。该试剂盒主要是利用目的蛋白质进行免疫沉淀，以分离与该蛋白结合的RNA。与现有的millipore公司的试剂盒相比，该试剂盒具有特异性高、效率高、耗时短、成本低、操作简便等优点，且不需要特别的仪器即可进行实验，所用试剂也皆为实验室常用试剂，大部分无毒无害；先使用福尔马林溶液使各种蛋白质结构固定，确保蛋白‑RNA复合物结构遭受破坏，降低RNA得率，同时使各种核酸酶失活，减少了其对RNA的降解。

摘要： 本发明提供一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法，属于免疫多肽分析技术领域，通过交联试剂制备免疫亲和柱，再对生物样本的裂解物进行免疫沉淀，从而富集得到HLA‑肽段复合物，再通过C18小柱进行一个简单的两步洗脱，该步骤可以同时实现免疫多肽的除杂和脱盐，回收的成分即可在浓缩后进行质谱检测，可以实现无论是细胞还是组织等生物样本中免疫多肽的高效提取，样品前处理过程不依赖复杂的仪器，即可完成免疫多肽的纯化和除盐，大大缩短操作所需时长。

摘要： 本发明涉及测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度的方法，具体地涉及采用免疫结合直接法或免疫沉淀分离法来测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度，作为临床判断动脉粥样硬化性疾病和冠心病以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病程度及疗效评估、预后判断的参考依据。

摘要： 本发明公开了一种基于质谱法评估免疫沉淀实验效果的方法，其包括以下步骤：将获得的免疫沉淀蛋白，采用清洗液清洗、蛋白酶酶解以及脱盐处理，获得可供质谱直接检测的肽段和/或蛋白样品；进行质谱检测，获取质谱图谱的原始数据，搜库解析图谱原始数据，获得肽段和/或蛋白鉴定和定量数据；所述数据包括第1项评估指标样品中总蛋白鉴定和定量情况及第2项评估指标诱饵蛋白定量数据在总蛋白定量列表中的排名；所述评估指标数据，按照如下评估原则进行评估：样品中总蛋白鉴定和定量情况越好，判断免疫沉淀实验样本量越多，效果越好；诱饵蛋白排名越高，判断免疫沉淀实验亲和富集效率和特异性越好。本发明可以快速、准确定量的评估免疫沉淀实验效果。

摘要： 本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及基于甲基化免疫沉淀高通量测序技术的肺癌检测方法。本发明使用靶向捕获技术进行ctDNA 5mC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。

摘要： 本申请提供了一种通过免疫沉淀分离和检测蛋白质的方法，以及用于实施该方法的试剂盒。

摘要： 一种基于蛋白AG微粒的免疫沉淀试剂盒，涉及试剂盒技术领域，该基于蛋白AG微粒的免疫沉淀试剂盒，包括盒体，所述盒体的上端安装有盒盖，所述盒体和盒盖的一侧安装有挂扣，所述盒体的内部安装有盒内胆，所述盒体的一侧安装有标签结构，所述盒内胆的内部安装有压缩结构，所述标签结构包括标签板，所述标签板的一侧开设有侧开口，所述标签板的上端开设有凹槽，所述标签板的一侧安装有安装柱，所述盒体的一侧开设有安装槽；在盒体使用过程中，使用者可将内部试剂的名称与生产时间进行标注，提高盒体的实用性，另外，压缩结构适用于不同高度的试剂摆放使用，在盒体的移动过程中，提高其稳定性。

摘要： 本实用新型涉及抗原抗体免疫反应领域，更具体地，涉及一种用于观察器皿中抗原抗体免疫沉淀线的便携式装置。一种用于观察器皿中抗原抗体免疫沉淀线的放大镜装置，包括支撑架以及放大镜镜体，所述支撑架上设有用于放置器皿的放置区，所述放大镜镜体位于所述放置区的上方且与所述支撑架可拆卸连接。操作人员在观察器皿中的抗原、抗体反应以及沉淀线的状态时，操作人员将加有抗原抗体反应介质的器皿放置在放置区中，然后将放大镜镜体安装在支撑架上，并使放大镜位于放置区的上方，进而可以使操作人员不需手持放大镜即可完成对器皿中抗原抗体反应情况的观察，节省了人力，提高了操作人员的工作效率。