伯氏疟原虫

摘要： 目的:研究伯氏疟原虫输出蛋白——红细胞膜相关蛋白1(EMAP1)在疟原虫生长发育和侵染中的作用,构建EMAP1缺失的伯氏疟原虫突变体。方法:以pL0035质粒为载体,PCR扩增EMAP1编码区上游和下游序列作为同源臂,用酶切连接和无缝克隆的方法将两条同源臂分别插入pL0035,获得重组质粒pL0035-ΔPbEMAP1;利用疟原虫转染技术在伯氏疟原虫中敲除EMAP1,有限稀释法筛选EMAP1基因敲除的单克隆虫株,PCR和Southern印迹鉴定基因型;定制抗PbEMAP1多克隆抗体,利用Western印迹鉴定EMAP1缺失疟原虫。结果:(1)成功构建用于敲除PbEMAP1的重组质粒pL0035-ΔPbEMAP1。(2)获得能有效识别PbEMAP1蛋白的抗体。(3)基因型和蛋白水平鉴定重组疟原虫为PbEMAP1缺失的伯氏疟原虫单克隆虫株。结论:本研究构建的PbEMAP1缺失伯氏疟原虫突变体,为研究PbEMAP1在疟原虫发育和侵染中的作用提供了必要的工具。

摘要： 目的 探讨感染伯氏疟原虫(P. berghei)小鼠血清的外泌体对红内期肝组织病理损伤的影响。方法 采用血清型总外泌体分离试剂法富集感染伯氏疟原虫小鼠血清的外泌体,透射电镜和Western blot鉴定外泌体。选取雌性昆明小鼠48只,随机分为4组:正常对照组(8只)、外泌体组(8只,每天每只鼠经尾静脉注射50μg外泌体)、感染组[16只,每只鼠经腹腔注射10^(6)个感染疟原虫红细胞(iRBC)]及感染+外泌体组(16只,每只鼠感染10^(6)个iRBC,且每天每只鼠经尾静脉注射50μg外泌体)。检测各组小鼠的生存时间、红细胞原虫感染率和脑型疟发生率,H&E染色观察肝组织病理变化,免疫组化检测肝组织M1型巨噬细胞标记物(iNOS)表达,以及qPCR检测肝组织促炎症/抑炎症细胞因子的mRNA表达水平。结果 在感染后第7~9天,感染组和感染+外泌体组均产生脑型疟模型小鼠和肝组织出现明显病理损伤。与感染组相比,感染+外泌体组小鼠的半数生存期显著缩短(P<0.05),脑型疟发生率显著升高(P<0.05),肝组织病理损伤显著加重(P<0.05),M1型巨噬细胞标记物(iNOS)表达显著上调(P<0.05)。同时,尾静脉注射外泌体后,感染小鼠肝组织的促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的mRNA水平显著上调(P<0.05),而抑炎症细胞因子(IL-4和IL-10)的mRNA水平显著下调(P<0.05)。结论 感染期血清外泌体可能通过促进肝组织巨噬细胞M1极化和诱导过度的促炎症反应,从而加重伯氏疟原虫红内期肝组织的病理损伤。

摘要： 为探讨伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)Pb22蛋白免疫血清的传播阻断能力,应用原核表达系统高效表达Pb22截短蛋白免疫小鼠后获得免疫血清。IFA实验证明Pb22截短蛋白免疫血清均可与疟原虫天然抗原结合。通过传播阻断实验,比较了Pb22截短蛋白和全长蛋白免疫血清的传播阻断效果,证明截短蛋白和全长蛋白对雄配子体出丝均有抑制作用,结果表明全长蛋白免疫小鼠的雄配子体出丝与对照组相比显著下降,截短蛋白免疫小鼠的雄性配子体出丝具有下降趋势但无统计学差异。全长蛋白和截短蛋白免疫小鼠的动合子形成数量较对照组均显著下降。以上结果表明抗Pb22截短蛋白免疫血清具有传播阻断能力,但阻断效果不如全长蛋白免疫血清。

摘要： 旨在系统分析伯氏疟原虫感染引起宿主T细胞、NK细胞、Tim-3表达及细胞因子的变化。选取64只雌性C57BL/6小鼠随机分为8组,每组8只,分别于感染后0、4、7、9、11、13、16和19 d获取小鼠脾及外周血免疫细胞,利用流式细胞术检测小鼠主要免疫细胞亚群及免疫检查点分子Tim-3表达水平的变化;同时检测血清中细胞因子的变化。结果表明,感染疟原虫后,小鼠脾CD3^(+)CD4^(+) T细胞、CD3^(+)CD8^(+) T细胞及NK细胞的比例均逐渐降低(P<0.01),且伴随着3种细胞Tim-3表达量的升高(P<0.01)。小鼠外周血CD3^(+)CD4^(+) T细胞的比例呈先降低后升高趋势,CD3^(+)CD8^(+) T细胞的比例呈先升高后降低趋势(P<0.05);小鼠外周血CD3^(-)NK1.1^(+)细胞的比例呈先降低后升高趋势,但感染末期,其比例仍低于未感染组(P<0.05)。Tim-3分子在外周血CD3^(+)CD4^(+) T细胞、CD3^(+)CD8^(+) T细胞及CD3^(-)NK1.1^(+)细胞的表达均显著升高(P<0.05)。感染疟原虫后,小鼠血清中促炎细胞因子IL-2的分泌量均显著高于未感染组(P<0.05);促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6在血清中分泌均呈先升高后降低趋势(P<0.05);具有免疫抑制作用的细胞因子IL-10呈逐渐升高趋势,且感染后期急剧升高(P<0.001)。以上结果表明,感染疟原虫后,小鼠的特异性免疫反应发挥了一定的杀伤作用,但由于Tim-3免疫检查点分子及一些发挥免疫抑制作用的细胞因子(IL-10)的过度表达,有利于疟原虫逃避宿主的免疫捕杀作用。该研究提示了从宿主免疫抑制角度研究疟原虫感染的重要性。

摘要： 目的探讨慢性旋毛虫(Trichinella spiralis,Ts)感染对伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA,PbA)共感染小鼠肝脏免疫病理的调节作用及其机制。方法将64只SPF级6~8周龄雌性昆明小鼠按体重(22~25 g)采用随机数字表法分为4组:对照组,不做处理;Ts单感染组(Ts组),每只小鼠口饲感染30条Ts幼虫;PbA单感染组(PbA组),每只小鼠于实验第121天经腹腔注射0.1 ml含1×10^(6)个感染PbA红细胞的磷酸盐缓冲液(PBS);Ts与PbA共感染组(Ts+PbA组):每只小鼠于口饲感染30条Ts幼虫后第121天经腹腔注射0.1 ml含1×10^(6)个感染PbA红细胞的PBS溶液。每组16只小鼠,其中每组10只小鼠用于观察生存率。PbA组和Ts+PbA组于感染PbA后第3天起每隔1天取尾静脉血,制作薄血膜涂片,进行吉姆萨染色,光镜下计数外周血红细胞PbA感染率。在感染Ts后第135天和/或感染PbA后第15天处死小鼠,称取小鼠体重和肝脏重量,计算肝脏指数;取感染Ts小鼠的新鲜膈肌制作肌肉压片,光镜下观察Ts幼虫囊包;光镜下,苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠肝脏组织病理改变,天狼星红染色观察比较各组肝脏组织的纤维化程度,免疫组织化学染色观察肝脏中F4/80+枯否氏细胞表达水平。结果感染Ts、PbA后,光镜下分别观察到膈肌组织中的Ts幼虫囊包和红细胞内的PbA。感染PbA后,PbA组和Ts+PbA组小鼠生存率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与PbA组比较,Ts+PbA组小鼠外周血红细胞PbA感染率在感染PbA后的第11、15天均较低(%:27.104±7.623比45.032±9.849,60.218±2.776比76.778±6.351,P均<0.05),小鼠肝脏指数和肝脏组织病理学评分也均较低(P均<0.05)。天狼星红染色结果显示,Ts+PbA组小鼠肝脏组织的纤维化阳性面积显著高于PbA组(P<0.05)。免疫组织化学染色显示,Ts+PbA组小鼠肝脏组织中F4/80+枯否氏细胞的平均光密度值显著高于PbA组(P<0.01)。结论慢性Ts感染可降低PbA共感染小鼠外周血红细胞的PbA感染率,增强肝脏组织F4/80+枯否氏细胞的表达,减轻肝脏免疫病理改变。

摘要： 脑型疟疾是一种常见而且严重的中枢神经系统感染性疾病,而锌离子是脑内含量丰富的必需微量元素之一,当兴奋性神经元被激活时,锌离子与兴奋性神经递质一同释放至突触间隙以调节神经冲动的传递。有研究表明,锌离子缺乏作为脑型疟疾感染的危险因素,但其具体作用机制尚不清楚。本研究通过腹腔注射伯氏疟原虫感染小鼠建立脑疟模型,探究锌离子参与脑疟发病和相关机制的研究。

摘要： 制备抗PbPH单克隆抗体(mAb),检测伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)PbPH的表达特点和传播阻断能力.主要通过蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和间接免疫荧光法(Indirect immunofluoscent assay,IFA),确定PbPH的表达阶段以及抗PbPH单克隆抗体的特异性.1×106个P.berghei感染雌性BALB/c小鼠3 d后,尾静脉收集感染小鼠的血液,与鼠源的抗PbPH单克隆抗体/PBS对照,按照不同的稀释倍数(1︰5、1︰10、1︰50)进行混合培养,观察15 min后疟原虫配子体出丝中心数及24 h后动合子形成数的变化.WB和IFA检测抗PbPH单克隆抗体可以识别雌雄配子体、雄配子、雌配子/合子、retort和动合子的表面抗原.体外传播阻断实验中,与PBS对照组相比,在加入不同浓度(1︰5、1︰10)的抗PbPH单克隆抗体培养后,配子体出丝中心数分别减少了41.7％、32.7％,差异具有统计学意义(P<0.05);动合子形成数分别减少了45.1％、14.8％,差异具有统计学意义(P<0.05).抗PbPH单克隆抗体可以有效阻断体外配子体出丝中心和动合子的形成,从而影响伯氏疟原虫在蚊体内的进一步发育和继续传播.

摘要： 目的 探讨慢性旋毛虫(Trichinella spiralis,Ts)感染对伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA,PbA)共感染小鼠肝脏免疫病理的调节作用及其机制.方法 将64只SPF级6～8周龄雌性昆明小鼠按体重(22～259)采用随机数字表法分为4组:对照组,不做处理;Ts单感染组(Ts组),每只小鼠口饲感染30条Ts幼虫;PbA单感染组(PbA组),每只小鼠于实验第121天经腹腔注射0.1 ml含1×106个感染PbA红细胞的磷酸盐缓冲液(PBS);Ts与PbA共感染组(Ts+PbA组):每只小鼠于口饲感染30条Ts幼虫后第121天经腹腔注射0.1 ml含1×106个感染PbA红细胞的PBS溶液.每组16只小鼠,其中每组10只小鼠用于观察生存率.PbA组Ts+PbA组于感染PbA后第3天起每隔1天取尾静脉血,制作薄血膜涂片,进行吉姆萨染色,光镜下计数外周血红细胞PbA感染率.在感染Ts后第135天和/或感染PbA后第15天处死小鼠,称取小鼠体重和肝脏重量,计算肝脏指数;取感染Ts小鼠的新鲜膈肌制作肌肉压片,光镜下观察Ts幼虫囊包;光镜下,苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠肝脏组织病理改变,天狼星红染色观察比较各组肝脏组织的纤维化程度,免疫组织化学染色观察肝脏中F4/80+枯否氏细胞表达水平.结果 感染Ts、PbA后,光镜下分别观察到膈肌组织中的Ts幼虫囊包和红细胞内的PbA.感染PbA后,PbA组和Ts+PbA组小鼠生存率比较,差异无统计学意义(P＞0.05);与PbA组比较,Ts+PbA组小鼠外周血红细胞PbA感染率在感染PbA后的第11、15天均较低(％:27.104±7.623比45.032±9.849,60.218±2.776比76.778±6.351,P均＜0.05),小鼠肝脏指数和肝脏组织病理学评分也均较低(P均＜ 0.05).天狼星红染色结果显示,Ts+PbA组小鼠肝脏组织的纤维化阳性面积显著高于PbA组(P＜0.05).免疫组织化学染色显示,Ts+PbA组小鼠肝脏组织中F4/80+枯否氏细胞的平均光密度值显著高于PbA组(P＜0.01).结论 慢性Ts感染可降低PbA共感染小鼠外周血红细胞的PbA感染率,增强肝脏组织F4/80+枯否氏细胞的表达,减轻肝脏免疫病理改变.

摘要： 目的 观察妊娠期母鼠感染疟原虫对子代鼠细胞免疫功能的影响,并研究胚胎期暴露疟原虫抗原的小鼠感染疟原虫后细胞免疫应答反应的变化.方法 选择清洁级成年昆明小鼠,雌雄小鼠合笼,将妊娠第14天的孕鼠按照随机数字表法分为实验组(n=5)和对照组(n=5),实验组每只小鼠经腹腔接种1×106个感染伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,P.b)的红细胞,对照组注射相同体积的生理盐水,孕鼠分娩后得到子代新生鼠(0、1、3、5d),继续饲养4周,得到4周龄子代鼠.流式细胞术检测子代新生鼠(0、1、3、5d)及4周龄子代鼠胸腺、脾脏CD4/CD8 T细胞亚群的变化;给予两组4周龄子代鼠腹腔接种P.b 1×106个/只,于第3天检测其胸腺、脾脏CD4/CD8 T细胞亚群的变化,并采用体外给予P.b抗原或有丝分裂原[刀豆蛋白A(ConA)]刺激方法检测两组子代鼠脾脏细胞对P.b抗原刺激的免疫反应.结果 与对照组比较,实验组子代新生鼠(0、1、3、5d)胸腺、脾脏中CD3+CD4+CD8-T细胞的比例均较高(P均＜ 0.05),而在胸腺中CD3+CD4-CD8+T细胞的比例均较低(P均＜ 0.05);与对照组比较,实验组4周龄子代鼠胸腺、脾脏中CD3+CD4+CD8-T细胞的比例均较高(P均＜ 0.05),而CD3+CD4-CD8+T细胞的比例均较低(P均＜0.05);4周龄子代鼠感染P.b后,与对照组比较,实验组胸腺、脾脏中CD3+CD4+CD8-T细胞的比例均较高(P均＜ 0.01),而CD3+CD4-CD8+T细胞的比例均较低(P均＜ 0.05).两组4周龄子代鼠脾脏细胞,体外给予P.b抗原或有丝分裂原ConA刺激后,实验组CD3+CD4+CD8-T细胞、CD3+CD4-CD8+T细胞比例与对照组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 妊娠期母鼠感染P.b可明显影响子代鼠胸腺和脾脏CD4/CD8 T细胞亚群的比例;并改变子代鼠对再感染P.b的细胞免疫应答反应.

摘要： 为探讨伯氏疟原虫滑动体相关蛋白40(P.berghei glideosome-associated protein 40,PbGAP40)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性,PCR扩增GAP40^(329-458 aa)编码基因并克隆入pET32a(+)载体,IPTG诱导PbGAP40重组蛋白(rPbGAP40)表达,纯化后免疫BALB/c小鼠。采集抗-PbGAP40免疫血清,通过ELISA和Western blot方法检测抗-PbGAP40免疫血清抗体滴度和特异性,IFA检测PbGAP40蛋白在伯氏疟原虫动合子期定位情况,体外实验检测抗-PbGAP40免疫血清对动合子期原虫发育的抑制效果。结果显示,成功表达rPbGAP40,抗-PbGAP40免疫血清抗体滴度为1∶51200;PbGAP40在合子、retort和成熟动合子表面表达。与对照组相比,抗-PbGAP40免疫血清处理组动合子生成数目下降36.5%(P<0.05),动合子转化率下降8.5%(P<0.05)。体外培养24 h后,抗-PbGAP40免疫血清处理组中61.2%的疟原虫停留在"retort"发育阶段。结果表明,PbGAP40可作为传播阻断疫苗的候选抗原。

摘要： 双氧青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的一种还原产物，能快速杀灭疟原虫控制疟疾的临床发作。但其脂溶性较大，吸收快，复燃率高。本研究对DHA体外透皮试验方法学进行研究，并制备出DHA软膏剂以伯氏鼠疟原虫红细胞内期感染小鼠为模型，观察双氢青蒿素软膏剂的抗疟作用，为其经皮给药系统制剂的研究提供参考。

摘要： 青蒿琥酯为青蒿素的衍生物，与青蒿素一样也具有抗疟活性，但也存在杀虫不彻底，易复燃，用药量大的不足。本研究以伯氏鼠疟原虫红细胞内期感染小鼠为模型，观察青蒿琥酯贴剂的抗疟作用，为其经皮给药系统制剂的研究提供参考。

摘要： 本发明涉及一种测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统。上述测定疟原虫含量的方法包括如下步骤：用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，细胞处理液中含有4.0g/L～6.0g/L的聚氧乙烯醚和4.0g/L～5.5g/L的4‑羟基哌嗪乙磺酸；将细胞悬液固液分离，收集沉降物，若待测样品含有携带疟原虫的细胞，则携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于沉降物中；采用拉曼光谱检测沉降物，获得沉降物对应的拉曼光谱；对拉曼光谱进行分析，若拉曼光谱在拉曼位移为1368cm‑1～1378cm‑1存在拉曼峰，则待测样品含有疟原虫。上述测定方法无需提取疟色素即可测定疟原虫含量，准确度高。

摘要： 本发明公开了一种检测恶性疟原虫HRP2和间日疟原虫LDH的结合蛋白组合及其制备方法和应用。所述结合蛋白组合由检测恶性疟原虫HRP2的结合蛋白1、结合蛋白2和检测间日疟原虫LDH的结合蛋白3、结合蛋白4组成，所述结合蛋白1～4的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8所示。本发明采用噬菌体展示技术以恶性疟原虫HRP2和间日疟原虫LDH为靶抗原，从噬菌体展示蛋白文库中淘选亲和力高、特异性好的结合蛋白组合。利用基因工程技术进行重组表达和纯化，以此结合蛋白组合试剂替代疟疾免疫检测中用抗体试剂，建立胶体金层析快速检测方法，所得试剂盒的储存稳定性高于现有临床检测产品，具有可靠、准确、安全、简便、稳定的优点。

摘要： 本发明公开了一种抗恶性疟原虫HRP‑II的抗体、检测恶性疟原虫的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗恶性疟原虫HRP‑II的抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体对恶性疟原虫的HRP‑II抗原的亲和力较高，使用该抗体检测恶性疟原虫具有较好的灵敏度和特异性。

摘要： 本申请涉及分子生物学检测术领域，提供了一种等温扩增检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种的试剂、试剂盒及其应用，其中，等温扩增检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种的试剂包括了SEQ ID No.1～SEQ ID No.30的用于检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种的环介导等温核酸扩增引物组，使得用于检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。

摘要： 本发明涉及疫苗V，其包含(A)至少一个分离的多肽链P，其包含(或由其组成)至少九个连续氨基酸部分是来自重复性细胞器蛋白，恶性疟原虫的推定蛋白或间日疟原虫的假定蛋白PVNG_04523，或编码多肽链P的多核苷酸链；(B)至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。此外，本发明涉及一种抗体，其可与重复性细胞器蛋白，恶性疟原虫的推定蛋白或间日疟原虫的假定蛋白PVNG_04523或它们的编码多核苷酸链相结合，并涉及其产生方法及其用途。

摘要： 本发明公开了一种检测恶性疟原虫HRP2和间日疟原虫LDH的结合蛋白组合及其制备方法和应用。所述结合蛋白组合由检测恶性疟原虫HRP2的结合蛋白1、结合蛋白2和检测间日疟原虫LDH的结合蛋白3、结合蛋白4组成，所述结合蛋白1～4的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8所示。本发明采用噬菌体展示技术以恶性疟原虫HRP2和间日疟原虫LDH为靶抗原，从噬菌体展示蛋白文库中淘选亲和力高、特异性好的结合蛋白组合。利用基因工程技术进行重组表达和纯化，以此结合蛋白组合试剂替代疟疾免疫检测中用抗体试剂，建立胶体金层析快速检测方法，所得试剂盒的储存稳定性高于现有临床检测产品，具有可靠、准确、安全、简便、稳定的优点。

摘要： 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；或与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95‑100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。该重组蛋白是一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，能够进一步提高疟疾传播阻断效果。

摘要： 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPgmp22)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPgmp22)的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；或与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95‑100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。该重组蛋白是一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，能够进一步提高疟疾传播阻断效果。

摘要： 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；或与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95‑100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。该重组蛋白是一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，能够进一步提高疟疾传播阻断效果。

摘要： 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPgmp22)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPgmp22)的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；或与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95‑100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。该重组蛋白是一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，能够进一步提高疟疾传播阻断效果。