冷冻电镜

摘要： 植物体的各项生理活动依赖于分子水平上多种植物蛋白质/蛋白质复合体的相互作用和动态变化,了解这些蛋白质/蛋白质复合体的结构和功能对于研究相关植物生理活动的分子机理至关重要。得益于最近的技术进步——包括直接电子探测器的发展和先进的图像处理算法,冷冻电镜技术已经逐步发展成为研究蛋白质/蛋白质复合体的重要技术手段,这也为深入理解植物生理活动分子机理提供了结构生物学研究利器。目前,冷冻电镜技术在分子植物学研究领域的应用仍处于早期,对于一些重要蛋白质复合体的结构功能研究还不够深入。本文在对冷冻电镜技术发展历史进行简要回顾的基础上,对近年来人们利用冷冻电镜技术在植物光合作用、胁迫响应等方面进行的分子机理研究进行了梳理,旨在为加强分子植物学和冷冻电镜技术两个研究领域的合作提供有益参考。

摘要： 2022年1月13日,浙江大学医学院基础医学院/良渚实验室张岩教授团队与四川大学华西医院邵振华教授团队合作在《自然·通信》(Nature Communications)发表了题为“Molecular mechanism of agonism and inverse agonism in ghrelinreceptor”的研究论文(DOI:10.1038/s41467-022-27975-9),报道了人源饥饿素受体与反向激动剂PF-05190457结合的晶体结构,以及内源性配体饥饿素激活受体后结合Go蛋白复合物的冷冻电镜结构。

摘要： 2022年7月15日,浙江大学生命科学学院赵烨教授和华跃进教授团队联合浙江大学医学院郭江涛教授团队在《结构》(Structure)杂志发表了题为“Mechanisms of helicase activated DNA end resection in bacteria”的研究成果(DOI:10.1016/j.str.2022.06.005)。该论文使用冷冻电镜首次解析了损伤DNA末端降解复合体Her A-Nur A完整八聚体复合物的结构,发现Nur A延伸到中央孔径的N端区域(ENR)调节了Her A-Nur A的解旋酶和核酸酶活性,揭示了损伤DNA末端切除的一种新型机制。

摘要： 2022年6月3日,浙江大学基础医学院郭江涛/杨帆研究员团队在《自然·通讯》(Nature Communications)在线发表了题为“Structures of a mammalian TRPM8 in closed state”的研究论文(DOI:10.1038/s41467-022-30919-y)。研究人员首先解析了小鼠瞬时受体电位(TRP)M8(MmTRPM8)在apo状态下的冷冻电镜结构,揭示了apo状态下完整的TRPM8通道孔区结构域,为解释TRPM8对钙离子的通透性提供了结构基础。

摘要： 针对冷冻电镜图像信噪比极低、颗粒与背景之间难以区分问题,提出了一种基于图像金字塔与非局部均值(NLM)去噪的冷冻电镜图像增强方法。先利用图像金字塔技术获取冷冻电镜图像中不同尺度的信息;然后在构建图像金字塔过程中循环使用NLM算法去除图像中的噪声,并运用图像背景矫正方法降低图像中的亮度不均现象;再对图像金字塔各级图像使用直方图变换方式进一步增强图像中颗粒与背景的区分度,最终使用图像上采样与图像融合技术将图像金字塔中的多层图像融合,形成冷冻电镜图像的增强图像。在原始与模拟的电镜图像上进行了实验,结果表明该方法能够有效提高图像峰值信噪比和结构相似度,颗粒与背景之间的区分度有显著提升,颗粒特征更为明显。

摘要： 蛋白质是生命的物质基础,通过与不同生物分子间的相互作用在生物体内执行着各项重要工作,其功能与结构直接相关。因此,解析蛋白质及其复合物高阶结构对于深入理解蛋白质功能、生理现象及药物研发具有重要意义。过去的60余年,随着X-射线晶体衍射(X-ray)、核磁共振(NMR)以及冷冻电镜(cryoEM)等技术的出现和不断发展,蛋白质结构解析取得了长足发展。

摘要： 单颗粒冷冻电镜图被广泛应用于生物大分子结构的重构,其中电镜图像聚类是三维重构的一个重要步骤.由于电镜图像信噪比极低、数据量大,使得电镜图像聚类成为非常具有挑战性的工作.根据电镜图像特点,本研究提出了一种基于对比学习的无监督冷冻电镜单颗粒图像聚类算法(CL-Clustering),对图像数据进行针对性的数据增强后,使用处理后的图像数据通过对比学习训练编码器,之后使用K-means++对编码器提取的特征进行聚类得到类别标签.该算法不需要使用人工数据集预训练,且在聚类迭代过程中不需要图像二维校准.在三种仿真数据集的不同信噪比梯度下,相比当前主流的基于极大似然估计的二维聚类(ML2D)算法,CL-Clustering聚类精度平均提升约10%;同时目标算法被应用到真实拍摄电镜图像并成功重构出了高分辨率三维结构.

摘要： B细胞抗原受体(BCR)由用于抗原识别的M、D、G、E或A类膜结合免疫球蛋白(mIg)和二硫键连接的Igα与Igβ异二聚体(Igα/β)组成,后者作为信号实体通过细胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)发挥作用。BCR的组织原则仍不清楚。在这里,研究人员报告了分辨率为8.2Å的小鼠全长IgM BCR及分辨率为3.3Å的Fab缺失的IgM BCR的冷冻电镜结构。在胞外域(ECD),Igα/β异二聚体主要使用Igα与一条重链(μHC)的Cμ3-Cμ4结构域结合,而将另一条重链(μHC’)空着。

摘要： 通过将冷冻电镜技术与深度学习技术相结合,应用卷积神经网络对白酒样品的冷冻电镜成像照片信息进行鉴别分类.采用冷冻电镜技术观测白酒微观形态时,选取36000×、73000×、120000×3种标称的放大倍数.实验结果表明,73000倍放大倍数的图像较为适合白酒样品的微观观测,白酒中存在一些体积相对较大的圆球状形态物质和一些体积相对较小的链状形态物质;对原酒、掺假白酒、成品酒3种类别进行分类,针对73000倍放大倍数的白酒微观图像分类识别所构建的卷积神经网络,本研究主要采用了LeNet-5、ResNet50、VGG16、GoogLeNet等网络结构,相对而言,ResNet50网络结构的效果最佳,结果显示,采用ResNet50网络结构时,样本训练准确率达到96％.

摘要： 冷冻电镜技术(Cryo-EM)起源于20世纪70年代,是结构生物学中蛋白质与核酸分子结构研究的重要技术手段。21世纪以来,计算机性能的提升与直接电子检测相机的极大发展,使得人们在小样本低剂量样本条件下仍可获得接近原子分辨率级的三维结构模型。由于三维结构模型是利用多角度投影,通过大量二维冷冻电镜单颗粒图像重构所得,因此,二维单颗粒图像的识别与分类直接影响最终模型的分辨率。目前,通过冷冻电镜获得的图像大部分噪声较多,因此对二维单颗粒图像的筛选,往往需要耗费有经验的科学工作者耗费大量时间。针对此问题,本文运用计算机图形学与机器学习相结合的方法,在预处理阶段以双边滤波器(Bilateral Filter)对信噪比较低的图像进行边缘优化,并通过直方图均衡化实现图像信息增强,最后以少量高置信度图像为训练样本,通过受限玻尔兹曼机(Restricted Boltzmann Machine,RBM)进行监督式学习并实现图像的分类与筛选,以提高二维单颗粒图像识别的效率与准确率。在方法检验阶段,首先,我们利用蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中已知的生物大分子结构,投影生成不同信噪比的模拟单颗粒模拟数据,验证了在低信噪比条件下应用本方法进行单颗粒图像识别分类的准确性。随后我们以瞬态受体电位离子通道蛋白子类V成员1 (Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1,TRPV1)的真实二维单颗粒图像数据集进行识别分类与三维模型重构,通过cryoSPARC平台,以约53%的原始数据量重构出了与原分辨率3.6Å相近的模型。因此,本研究不仅提高了传统人工筛选的效率,也为冷冻电镜单颗粒二维图像识别提供了新思路。

摘要： 目的:对重组肠道病毒71型(EV71)类病毒颗粒的三维结构进行测定与分析.rn 方法:利用多形汉逊酵母菌株重组表达EV71类病毒颗粒,经过多步纯化工艺获得高纯度的EV71类病毒颗粒疫苗原液,采用冷冻电镜三维重构技术,收集EV71类病毒颗粒的冷冻电镜数据,通过数据处理与结构计算获得EV71类病毒颗粒的三维重构密度图,并与已解析的EV71成熟病毒与天然空心颗粒的晶体结构进行比对.rn 结果:利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术获得了分辨率为4.2埃的EV71类病毒颗粒的三维结构.三维重构结果显示,重组EV71类病毒颗粒为空心球状颗粒,直径约33nm,具有二十面体对称结构,在二次轴部位具有一个联通内外的孔洞,与EV71天然空心颗粒的结构相似度较高,而与EV71成熟病毒具有结构差异.rn 结论：本研究所获得的重组EV71类病毒颗粒冷冻电镜三维结构为将来开展EV71抗原-抗体复合物结构解析与分析工作建立了重要的基础。

摘要： 果子狸是一种低等哺乳动物,也是SARS等重要病原的宿主.本研究利用冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒三维重构技术获得了从果子狸中分离的呼肠孤病毒(MRV)MPC/04株的较高分辨率的三维结构.三维重构结果显示,果子狸呼肠孤病毒MPC/04株具有哺乳动物呼肠孤病毒典型的形态.该病毒由内外两层衣壳蛋白组成,呈二十面体对称结构.内衣壳的外面包裹着一层由200个μl3σ33异源六聚体复合物构成的外衣壳,三角形剖分函数T=13.同时我们还观察到了该病毒主要蛋白之间的连接方式.本研究为不同宿主的呼肠孤病毒的形态和结构比较研究提供了有益数据.

摘要： 为了有效地发掘和利用异构系统在应用和体系结构上的并行性,以冷冻电镜三维重构为例展示如何利用应用程序潜在的并行性。通过分析重构计算所有的并行性,实现了将动态自适应的划分算法用于任务在异构系统上高效的分发。在曙光星云系统的部分节点系统(32节点)上评估并行化的程序性能。实验证明:多层次的并行化是CPU与GPU异构系统上开发并行性的有效模式；CPU-GPU混合程序在给定问题规模上相对单纯CPU程序获得2.4倍加速比。

摘要： 本文介绍了冷冻电镜三维重构(CryoEM)技术及其面临的颗粒图像信噪比极低、三维重构计算时间极其漫长、急需新的重构算法等问题，并指出了未来的研究趋势。

摘要： 冷冻电镜是研究生物大分子结构的重要手段，本文研究了冷冻电镜技术的关键问题之一，重构三维密度数据的分析问题。我们研究设计了一个冷冻电镜重构数据的可视分析系统-VAT4M。VAT4M把体绘制引入该数据的可视化中，研究了基于GPU硬件加速的raycasting算法，帮助生物学家快速轻松的发现隐含的数据内涵。在数据分析处理方面，利用了病毒结构的特点，提出了自动分割算法和骨架搜索算法。最后给出了应用实例。

摘要： 在组成HIV病毒的各个分子中，包膜蛋白ENV(包括表面蛋白gp120和穿膜蛋白gp41)以三聚体形式暴露在病毒表面。作为唯一由病毒本身表达并暴露在病毒表面的蛋白，HIV表面的ENV蛋白三聚体和靶细胞受体CD4和趋化因子结合启动HIV和靶细胞的融合过程，在HIV-1的感染周期，特别是在病毒进入靶细胞的融合过程中起着决定性的作用。所以ENV三聚体的结构组成细节对深入分析病毒的融合过程，特别是设计针对融合过程的中和/阻断分子非常关键。理想状况下，人们希望得到ENV三聚体的高精度的三维品体结构，但由于ENV蛋白的高度变异性，这方面的工作非常困难。

摘要： 我们从白蚊伊蚊(Aedes albopictus)C6/36培养细胞中分离纯化出一种以前未报道过的浓核病毒,命名为白蚊伊蚊C6/36培养细胞浓核病毒,简称C6/36 DNV.浓核病毒是细小病毒科的一个亚科,C6/36 DNV属于其下的短浓核病毒属,直径约26nm,衣壳呈二十面体对称结构.本研究利用冷冻电镜和计算机三维重构技术测定了该病毒的1.1nm分辨率的三维结构,这是目前唯一被测定结构的短浓核病毒属的病毒.

摘要： 本发明公开了一种冷冻电镜单晶样品的制备方法及冷冻电镜单晶样品，涉及冷冻电镜领域，该方法包括依据单晶样品的晶面特性分离单晶样品，以减小单晶样品的厚度尺寸，获得破碎单晶；在破碎单晶上施加剪切力，使破碎单晶穿晶断裂，在第一微栅载网上形成细化晶粒；从第一微栅载网上去除不规则的细化晶粒，获得目标取向晶面的目标细化晶粒；通过第二微栅载网与第一微栅载网在目标细化晶粒的两侧施加作用力，使目标细化晶粒粘附于第二微栅载网朝向第一微栅载网的一侧表面，形成目标晶面薄层样品。本发明解决了如何提高冷冻电镜用于电子束敏感单晶样品表征时样品制备可控性的问题，实现了控制电子束敏感单晶样品的减薄，获得目标晶面薄层样品。

摘要： 本发明涉及快速变温冷冻装置及冷冻电镜样品去玻璃化制备方法，快速变温冷冻装置包括冷冻架，冷冻铜杯、加热装置和温度探测器，冷冻铜杯紧配合连接于冷冻架的中心孔内，冷冻铜杯内用于加载固液混合态乙烷，加热装置设于冷冻铜杯的外筒壁上，并与冷冻铜杯热传导连接，用于对冷冻铜杯内的固液混合态乙烷进行加热，温度探测器设于冷冻铜杯上，用于检测冷冻铜杯内的固液混合态乙烷的温度。冷冻电镜样品制备时将载有样品溶液的样品载网投入冷冻铜杯内进行冷冻，完成后控制加热装置启动对固液混合态乙烷进行加热，加热至去玻璃化温度，对冷冻电镜样品进行去玻璃化处理，以消除电镜样品因快速冷冻产生的内应力，从而改善冷冻电镜样品图像中的漂移问题。

摘要： 本发明公开了一种用于真核细胞样本的冷冻电镜制样方法，属于冷冻电镜制样领域。所述方法包括以下步骤：以冷冻电镜的载网作为基底，在所述基底上负载纳米氧化铝薄膜，然后将其在‑175°C~‑160°C液态乙烷中处理3‑5min；向冷冻后的载网上添加待测样品形成超薄液膜，置于液态氮中冷冻保存待用。本发明通过直接在冷冻电镜上负载纳米氧化铝薄膜作为支持膜，操作简单易实现；利用纳米氧化铝薄膜导电性强、机械性能高、亲水性好等性质，将其负载于冷冻电镜载网后，由于纳米氧化铝薄膜表面存在丰富的失配键和欠氧键，孔洞丰富，易于吸附细胞，促使细胞均匀单层分布，利于提高细胞样品冷冻制样的观察效果。

摘要： 本发明公开了一种冷冻电镜样品无接触制备装置及方法，将样品载网设于传输模块上并进行固定，通过移液枪吸取样品溶液并滴加于经过表面亲水化处理的样品载网上，调节自动吹吸模块向靠近样品载网的方向移动，使自动吹吸模块端部与样品载网边缘相切，然后控制自动吹吸模块以正压喷发气流或负压吸收气流模式运行，通过气流移除样品载网表面的多余样品溶液以在样品载网上形成薄液膜，通过传输模块将样品载网送至制冷装置内进行冷冻，以获得厚度均匀的冷冻电镜样品。冷冻电镜样品制备过程中，自动吹吸模块不直接与样品载网接触，有效避免了滤纸吸附方式带来的不利影响，能制出大范围均匀的薄冰层冷冻电镜样品，提高了冷冻样品制备成功率与可重复性。

摘要： 本发明公开了一种多功能化石墨烯载网在冷冻电镜三维重构中的应用。多功能化石墨烯载网的制备方法：刻蚀采用CVD生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔，即得到石墨烯载网；将石墨烯载网进行氧等离子体处理；然后采用含有EDC和NHS的MES缓冲液处理石墨烯载网；再采用氨三乙酸和生物素活化石墨烯载网；最后与镍盐反应即得。多功能化石墨烯载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免空气与水的界面问题，而且还能控制颗粒取向分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，提供丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加可靠以及更加高效，因此，多功能化石墨烯载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。

摘要： 本发明涉及一种基于图像金字塔与NLM的冷冻电镜图像增强方法。针对冷冻电镜图像信噪比极低，从中挑选出颗粒图像困难的情况，本发明对图像循环使用NLM去噪、背景矫正、下采样形成图像金字塔，各级图像经过直方图变换与上采样后融合成为最终增强图像，提高了背景与颗粒的区分度。本发明提出的图像增强方法所得结果与其他方法相比，图像峰值信噪比和结构相似度均有明显提高。

摘要： 本发明公开了一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法及装置。通过设计微流控芯片，使生化反应的底物进入微流控芯片的反应通道，在反应发生后的不同时间点通过连接在反应通道不同位置处的输出通道将反应溶液引出，并通过枪头快速涂写或喷射在金属载网上，获取反应过程中不同时间点上的样品，然后快速进行冷冻制样，实现对时间分辨的样品进行冷冻电镜数据采集和分析。本发明使捕获生物样品短时间尺度（如微秒级）的中间状态成为可能，从而获得生物分子三维结构与构象分布随时间的演化特征。

摘要： 本发明公开了一种生物分子冷冻电镜数据的构象分类方法，属于结构生物学与计算科学的交叉领域。本发明在卷积残差神经网络模型的基础上，对冷冻电镜单颗粒数据进行有监督的高精度构象分类，以发现生物分子的新构象类，使单颗粒图像数据进行性能更为强大的监督分类成为可能，从而获得生物分子潜在新构象状态的结构。

摘要： 本申请提供了一种神经网络模型训练方法和装置、冷冻电镜密度图分辨率估计方法和装置、计算机设备，以及存储介质，解决了现有技术中冷冻电镜密度图的分辨率估计算法输入数据不易获得、计算时间长的问题。神经网络模型训练方法包括：基于第一目标冷冻电镜密度图确定掩膜值、局部分辨率波动值和全局分辨率值，第一目标冷冻电镜密度图标注有掩膜值标签、局部分辨率波动值标签和全局分辨率值标签；基于掩膜值、局部分辨率波动值和全局分辨率值对神经网络模型进行训练，以使掩膜值趋近于掩膜值标签、局部分辨率波动值趋近于局部分辨率波动值标签、全局分辨率值趋近于全局分辨率值标签。

摘要： 本实用新型涉及一种用于冷冻电镜技术的冷冻制样设备，属于冷冻制样技术领域，其中冷冻制样设备包括样品仓、制冷装置、夹取件、驱动装置和雾伞罩；样品仓设有与外部相通的样品仓通口；制冷装置与样品仓通口相对设置；夹取件用于夹取放置生物大分子或者细胞的载网，夹取件设置于样品仓与制冷装置之间；驱动装置用于驱动夹取件在样品仓与制冷装置之间作直线往复运动，以使夹取件可通过样品仓通口进入样品仓，也可使夹取件离开样品仓，以靠近制冷装置；雾伞罩用于阻挡样品仓中气体与制冷装置接触，雾伞罩设置于制冷装置与样品仓通口之间。本实用新型提供的用于冷冻电镜技术的冷冻制样设备能够在制备过程中减少产生的冰晶，降低冰晶对冷冻样品的污染。