ESAT-6

摘要： 为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:通过SDSPAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。

摘要： 目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体。PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2。将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2。RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定。结果Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因。IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白。结论成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础。

摘要： 目的 探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(GrB)水平对儿童活动性结核(ATB)的诊断价值.方法 选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATB 26例、结核潜伏感染(LTBI)20例、非结核病对照(Non-TB)20例,健康对照(HC)20例],ELISA检测ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后GrB水平,流式细胞术检测表达GrB和干扰素-γ(IFN-γ)的CD4+T、CD8+T细胞比例.结果ESAT-6/CFP-10刺激后结核组特异性GrB较对照组显著升高(P＜0.001),且LTBI组显著高于ATB组(P＜0.001).CD4+T、CD8+T细胞均可分泌GrB.结论 结核特异性GrB对儿童活动性结核的鉴别诊断可能具有重要价值.

摘要： 目的 分析临床辅助诊断结核性脑膜炎患者中ESAT-6(早期分泌靶抗原6)、IL-10(白细胞介素-10)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IFN-γ(干扰素-γ)的应用意义.方法 选取2018年12月至2020年6月本院接收的114疑似颅神经疾病患者作为研究对象,根据临床诊断结果分为研究组(结核性脑膜炎患者,n=57)和常规组(非结核性脑膜炎患者,n=57).比较两组脑脊液细胞因子(ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)水平.结果 研究组ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均明显高于常规组(P<0.05).IFN-γ水平与ESAT-6水平呈正相关(P<0.05).联合检测敏感度、阴性预测值与阳性预测值均高于单一检测(P<0.05).结论 结核性脑膜炎患者脑脊液细胞因子表达水平较高,ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ4联合检测具有敏感度较高,有助于临床辅助诊断,值得临床推广运用.

摘要： 目的 探讨肺结核活动程度对结核感染T细胞斑点试验反应强度的影响.方法 选取2018年6月至12月期间在昆明市第三人民医院结核二科400例活动性肺结核患者,所有患者均进行了结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB),对比分析活动性肺结核患者,在不同病情状态下,T-SPOT.TB的免疫强度.结果 180例病原学阳性肺结核,T-SPOT.TB阳性率为96.1％(173/180);220例病原学阴性肺结核,T-SPOT.TB阳性率86.4％(190/220),两者χ2检验比较差异有统计学意义(χ2=11.205,P=0.0010.05).病原学阳性且T-SPOT.TB阳性173例肺结核患者中,按照抗酸杆菌涂片量(1条～1+、2+、3+、4+)进行分组比较,4组抗原ESAT-6、CFP-10进行比较,差异无统计学意义(P=0.792,0.595,均>0.05);按治疗史分为初治、复治肺结核,两组间抗原ESAT-6、CFP-10比较,其中抗原ESAT-6在初、复治肺结核比较中有统计学差异(Z=-2.178 P=0.0050.05);按照耐药状况分非耐药、耐药肺结核,两组间抗原ESAT-6、CFP-10比较无统计学差异(P=0.748,0.845,均>0.05).结论 结核感染T细胞斑点试验对诊断活动性肺结核的敏感性较好,利用其应答强度反映结核感染活动程度有一定临床意义.

摘要： 目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)对肺结核治疗效果的监测意义.方法 采用T-SPOT.TB试剂盒,检测其抗原ESAT-6和CFP-10的应答,对比79例活动性肺结核患者治疗前与治疗2月末及治疗结束时ESAT-6和CFP-10应答结果的变化.结果 79例活动性肺结核患者,ESAT-6和CFP-10应答的斑点数在治疗2月末和治疗结束时较治疗初均有明显下降,与治疗初比较,差异均有统计学意义(P0.05);全部患者T-SPOT.TB转阴率为3.8％.治疗2月末与治疗结束时ESAT-6应答变化,差异有统计学意义(χ2=4.635,P=0.0310.05).结论 T-SPOT.TB治疗前后ESAT-6、CFP-10应答变化有明显差异,对肺结核治疗效果评价有一定作用,但不能利用其转阴率作为肺结核治疗停药指标.

摘要： 目的探讨肺结核活动程度对结核感染T细胞斑点试验反应强度的影响。方法选取2018年6月至12月期间在昆明市第三人民医院结核二科400例活动性肺结核患者,所有患者均进行了结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB),对比分析活动性肺结核患者,在不同病情状态下,T-SPOT.TB的免疫强度。结果180例病原学阳性肺结核,T-SPOT.TB阳性率为96.1%(173/180);220例病原学阴性肺结核,T-SPOT.TB阳性率86.4%(190/220),两者χ2检验比较差异有统计学意义(χ2=11.205,P=0.0010.05)。病原学阳性且T-SPOT.TB阳性173例肺结核患者中,按照抗酸杆菌涂片量(1条~1+、2+、3+、4+)进行分组比较,4组抗原ESAT-6、CFP-10进行比较,差异无统计学意义(P=0.792,0.595,均>0.05);按治疗史分为初治、复治肺结核,两组间抗原ESAT-6、CFP-10比较,其中抗原ESAT-6在初、复治肺结核比较中有统计学差异(Z=-2.178 P=0.0050.05);按照耐药状况分非耐药、耐药肺结核,两组间抗原ESAT-6、CFP-10比较无统计学差异(P=0.748,0.845,均>0.05)。结论结核感染T细胞斑点试验对诊断活动性肺结核的敏感性较好,利用其应答强度反映结核感染活动程度有一定临床意义。

摘要： [背景]10 kD培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10,CFP10)和6 kD早期分泌性抗原靶蛋白(early secretary antigenic target-6 kD,ESAT6)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)重要的毒力因子,能引起巨噬细胞的凋亡.[目的]探讨CFP10和ESAT6对巨噬细胞RAW264.7凋亡及AIM2/ASC/Caspase-8信号通路的影响.[方法]利用大肠杆菌表达并纯化获得了CFP10和ESAT6蛋白,重组蛋白处理巨噬细胞RAW264.7后,利用CCK8试剂盒检测细胞存活率,确定重组蛋白处理细胞浓度,利用Western blotting技术检测细胞凋亡相关蛋白及AIM2和ASC炎性小体的变化,利用流式细胞术检测细胞凋亡率.[结果]SDS-PAGE和Western blotting结果表明重组蛋白CFP10和ESAT6表达正确,不同浓度的CFP10和ESAT6处理RAW264.7后,对细胞的增殖能力具有明显的抑制作用,当CFP10和ESAT6单独处理且浓度为5 μg/mL时,细胞存活率较对照组有显著下降(P＜0.001),且随着蛋白浓度的增加细胞存活率显著下降(P＜0.001).Western blotting结果表明,CFP10和ESAT6蛋白单独处理巨噬细胞24 h后均能引起巨噬细胞发生凋亡.当终浓度为5μg/mL的CFP10和ESAT6共处理巨噬细胞时,共处理组凋亡相关蛋白BAD、CHOP、Caspase-8和Caspase-3较ESAT6单独处理组有极显著差异(P＜0.001),说明CFP10和ESAT6共处理显著降低了ESAT6单独处理引起的巨噬细胞的凋亡,进一步研究发现ESAT6能激活AIM2、ASC炎性小体.[结论]结核分枝杆菌CFP10和ESAT6处理RAW264.7后均能引起巨噬细胞发生凋亡,当二者共处理时,CFP10会显著降低ESAT6单独处理引起的细胞的凋亡,进一步的研究表明,ESAT6可能通过激活AIM2/ASC/Caspase-8信号通路从而引起巨噬细胞发生凋亡.研究结果为进一步探究Mtb感染过程中CFP10和ESAT6蛋白对巨噬细胞凋亡的调控作用及其分子机制奠定了基础.

摘要： 目的探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)对肺结核治疗效果的监测意义。方法采用TSPOT.TB试剂盒,检测其抗原ESAT-6和CFP-10的应答,对比79例活动性肺结核患者治疗前与治疗2月末及治疗结束时ESAT-6和CFP-10应答结果的变化。结果 79例活动性肺结核患者,ESAT-6和CFP-10应答的斑点数在治疗2月末和治疗结束时较治疗初均有明显下降,与治疗初比较,差异均有统计学意义(P 0.05);全部患者T-SPOT.TB转阴率为3.8%。治疗2月末与治疗结束时ESAT-6应答变化,差异有统计学意义(χ^(2)=4.635,P=0.031 0.05)。结论 T-SPOT.TB治疗前后ESAT-6、CFP-10应答变化有明显差异,对肺结核治疗效果评价有一定作用,但不能利用其转阴率作为肺结核治疗停药指标。

摘要： 目的ESAT-6蛋白是结核分枝杆菌的毒力因子，为了用酵母双杂交方法筛选易感家畜动物细胞中与该蛋白分子相互作用的分子，本实验构建了ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体。方法根据结核分枝杆菌H37Rv的ESAT-6基因序列(登录号：38490389)设计一对引物，P1：5-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGA-3'P2：5'-GTCGACCTATGCGAACATCCCAGTG-3'下划线部分为限制性酶切位点EcoR1和Sal1。以80°C作用30min热灭活结核分枝杆菌H37Rv菌悬液为模板，应用PCR技术(20μL PCR 反应的体系中加入：10×反应缓冲液(含15mmol／L Mgcl2)2μL,dNTP(各2.5 mmol／L)0.8μL,P1(25μ mol／L)0.25μL，P2(25μmol/L)0.25μL，模板0.5μL，Taq酶0.75U，补水至20μL;PCR反应条件：94°C4min;94°Clmin，52°C 40S，72°C1min，30个循环;最后72°C延伸7min)特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因，将其克隆入pGM-T载体中，该质粒经PCR方法和限制性内切酶EcoR I和SalI双酶切方法鉴定分析后。进行DNA测序鉴定。将序列正确的ESAT-6基因片段亚克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中，用PCR和限制性酶切进行鉴定。构建了诱饵质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG／LiAc法(在每个1.5mL离心管中，加入诱饵载体pGBKT7-ESAT-6质粒0.1μg，再加入5μL鲑鱼精担体DNA(Herring Tests carrier DNA)及50μL酵母感受态细胞，轻轻混匀后，再加0.5mL PEG／LiAc溶液振荡混匀后，在30°C下振荡培养30min后，在管中加入20iμL DMSO,混匀，于42°C水浴15min，冰浴1-2min，再于室温离心(12000 r／min)15s，弃上清，用lmL YPD Plus液体培养基重悬酵母细胞，将转化的酵母细胞于30°C下振荡培901min，离心(3000 r／rain)5min，弃上清，用0.9％(W／V)的NaCl溶液重悬酵母细胞，将酵母细胞悬液涂于SD／-Trp固体培养基上，30°C培养3d，可见白色克隆出现。转化时以pGBKT7-Lain和pGBKT7为对照质粒。)将其转入酵母AH109h中，经表型筛选(挑取直径大于2mm的克隆，混悬于200μL的0.9％(W/V) NaCl溶液中，再将此悬液分别涂于SD／-Leu和SD／-His固体培养基上，30°C培养观察4－5d。)检测其自激活作用。结果载有pGBKT7-ESAT-6质粒的酵母感受态细胞涂在sD/Trp固体培养基上，培养3d，长出白色克隆。将此克隆接种于SD／-Leu固体培养基和SD／-His固体培养基上，培养3d，均无菌落生长(图8-2)。结论本实验构建的pGBKT7-ESAT-6质粒无自激活作用，可用于酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。

摘要： 目的ESAT-6蛋白是结核分枝杆菌的毒力因子，为了用酵母双杂交方法筛选易感家畜动物细胞中与该蛋白分子相互作用的分子，本实验构建了ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体。方法根据结核分枝杆菌H37Rv的ESAT-6基因序列(登录号：38490389)设计一对引物，P1：5-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGA-3'P2：5'-GTCGACCTATGCGAACATCCCAGTG-3'下划线部分为限制性酶切位点EcoR1和Sal1。以80°C作用30min热灭活结核分枝杆菌H37Rv菌悬液为模板，应用PCR技术(20μL PCR 反应的体系中加入：10×反应缓冲液(含15mmol／L Mgcl2)2μL,dNTP(各2.5 mmol／L)0.8μL,P1(25μ mol／L)0.25μL，P2(25μmol/L)0.25μL，模板0.5μL，Taq酶0.75U，补水至20μL;PCR反应条件：94°C4min;94°Clmin，52°C 40S，72°C1min，30个循环;最后72°C延伸7min)特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因，将其克隆入pGM-T载体中，该质粒经PCR方法和限制性内切酶EcoR I和SalI双酶切方法鉴定分析后。进行DNA测序鉴定。将序列正确的ESAT-6基因片段亚克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中，用PCR和限制性酶切进行鉴定。构建了诱饵质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG／LiAc法(在每个1.5mL离心管中，加入诱饵载体pGBKT7-ESAT-6质粒0.1μg，再加入5μL鲑鱼精担体DNA(Herring Tests carrier DNA)及50μL酵母感受态细胞，轻轻混匀后，再加0.5mL PEG／LiAc溶液振荡混匀后，在30°C下振荡培养30min后，在管中加入20iμL DMSO,混匀，于42°C水浴15min，冰浴1-2min，再于室温离心(12000 r／min)15s，弃上清，用lmL YPD Plus液体培养基重悬酵母细胞，将转化的酵母细胞于30°C下振荡培901min，离心(3000 r／rain)5min，弃上清，用0.9％(W／V)的NaCl溶液重悬酵母细胞，将酵母细胞悬液涂于SD／-Trp固体培养基上，30°C培养3d，可见白色克隆出现。转化时以pGBKT7-Lain和pGBKT7为对照质粒。)将其转入酵母AH109h中，经表型筛选(挑取直径大于2mm的克隆，混悬于200μL的0.9％(W/V) NaCl溶液中，再将此悬液分别涂于SD／-Leu和SD／-His固体培养基上，30°C培养观察4－5d。)检测其自激活作用。结果载有pGBKT7-ESAT-6质粒的酵母感受态细胞涂在sD/Trp固体培养基上，培养3d，长出白色克隆。将此克隆接种于SD／-Leu固体培养基和SD／-His固体培养基上，培养3d，均无菌落生长(图8-2)。结论本实验构建的pGBKT7-ESAT-6质粒无自激活作用，可用于酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。

摘要： 目的ESAT-6蛋白是结核分枝杆菌的毒力因子，为了用酵母双杂交方法筛选易感家畜动物细胞中与该蛋白分子相互作用的分子，本实验构建了ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体。方法根据结核分枝杆菌H37Rv的ESAT-6基因序列(登录号：38490389)设计一对引物，P1：5-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGA-3'P2：5'-GTCGACCTATGCGAACATCCCAGTG-3'下划线部分为限制性酶切位点EcoR1和Sal1。以80°C作用30min热灭活结核分枝杆菌H37Rv菌悬液为模板，应用PCR技术(20μL PCR 反应的体系中加入：10×反应缓冲液(含15mmol／L Mgcl2)2μL,dNTP(各2.5 mmol／L)0.8μL,P1(25μ mol／L)0.25μL，P2(25μmol/L)0.25μL，模板0.5μL，Taq酶0.75U，补水至20μL;PCR反应条件：94°C4min;94°Clmin，52°C 40S，72°C1min，30个循环;最后72°C延伸7min)特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因，将其克隆入pGM-T载体中，该质粒经PCR方法和限制性内切酶EcoR I和SalI双酶切方法鉴定分析后。进行DNA测序鉴定。将序列正确的ESAT-6基因片段亚克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中，用PCR和限制性酶切进行鉴定。构建了诱饵质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG／LiAc法(在每个1.5mL离心管中，加入诱饵载体pGBKT7-ESAT-6质粒0.1μg，再加入5μL鲑鱼精担体DNA(Herring Tests carrier DNA)及50μL酵母感受态细胞，轻轻混匀后，再加0.5mL PEG／LiAc溶液振荡混匀后，在30°C下振荡培养30min后，在管中加入20iμL DMSO,混匀，于42°C水浴15min，冰浴1-2min，再于室温离心(12000 r／min)15s，弃上清，用lmL YPD Plus液体培养基重悬酵母细胞，将转化的酵母细胞于30°C下振荡培901min，离心(3000 r／rain)5min，弃上清，用0.9％(W／V)的NaCl溶液重悬酵母细胞，将酵母细胞悬液涂于SD／-Trp固体培养基上，30°C培养3d，可见白色克隆出现。转化时以pGBKT7-Lain和pGBKT7为对照质粒。)将其转入酵母AH109h中，经表型筛选(挑取直径大于2mm的克隆，混悬于200μL的0.9％(W/V) NaCl溶液中，再将此悬液分别涂于SD／-Leu和SD／-His固体培养基上，30°C培养观察4－5d。)检测其自激活作用。结果载有pGBKT7-ESAT-6质粒的酵母感受态细胞涂在sD/Trp固体培养基上，培养3d，长出白色克隆。将此克隆接种于SD／-Leu固体培养基和SD／-His固体培养基上，培养3d，均无菌落生长(图8-2)。结论本实验构建的pGBKT7-ESAT-6质粒无自激活作用，可用于酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。

摘要： 目的ESAT-6蛋白是结核分枝杆菌的毒力因子，为了用酵母双杂交方法筛选易感家畜动物细胞中与该蛋白分子相互作用的分子，本实验构建了ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体。方法根据结核分枝杆菌H37Rv的ESAT-6基因序列(登录号：38490389)设计一对引物，P1：5-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGA-3'P2：5'-GTCGACCTATGCGAACATCCCAGTG-3'下划线部分为限制性酶切位点EcoR1和Sal1。以80°C作用30min热灭活结核分枝杆菌H37Rv菌悬液为模板，应用PCR技术(20μL PCR 反应的体系中加入：10×反应缓冲液(含15mmol／L Mgcl2)2μL,dNTP(各2.5 mmol／L)0.8μL,P1(25μ mol／L)0.25μL，P2(25μmol/L)0.25μL，模板0.5μL，Taq酶0.75U，补水至20μL;PCR反应条件：94°C4min;94°Clmin，52°C 40S，72°C1min，30个循环;最后72°C延伸7min)特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因，将其克隆入pGM-T载体中，该质粒经PCR方法和限制性内切酶EcoR I和SalI双酶切方法鉴定分析后。进行DNA测序鉴定。将序列正确的ESAT-6基因片段亚克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中，用PCR和限制性酶切进行鉴定。构建了诱饵质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG／LiAc法(在每个1.5mL离心管中，加入诱饵载体pGBKT7-ESAT-6质粒0.1μg，再加入5μL鲑鱼精担体DNA(Herring Tests carrier DNA)及50μL酵母感受态细胞，轻轻混匀后，再加0.5mL PEG／LiAc溶液振荡混匀后，在30°C下振荡培养30min后，在管中加入20iμL DMSO,混匀，于42°C水浴15min，冰浴1-2min，再于室温离心(12000 r／min)15s，弃上清，用lmL YPD Plus液体培养基重悬酵母细胞，将转化的酵母细胞于30°C下振荡培901min，离心(3000 r／rain)5min，弃上清，用0.9％(W／V)的NaCl溶液重悬酵母细胞，将酵母细胞悬液涂于SD／-Trp固体培养基上，30°C培养3d，可见白色克隆出现。转化时以pGBKT7-Lain和pGBKT7为对照质粒。)将其转入酵母AH109h中，经表型筛选(挑取直径大于2mm的克隆，混悬于200μL的0.9％(W/V) NaCl溶液中，再将此悬液分别涂于SD／-Leu和SD／-His固体培养基上，30°C培养观察4－5d。)检测其自激活作用。结果载有pGBKT7-ESAT-6质粒的酵母感受态细胞涂在sD/Trp固体培养基上，培养3d，长出白色克隆。将此克隆接种于SD／-Leu固体培养基和SD／-His固体培养基上，培养3d，均无菌落生长(图8-2)。结论本实验构建的pGBKT7-ESAT-6质粒无自激活作用，可用于酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。

摘要： 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应，探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每1mL全血与1ml RPMI 1640完全培养基，并分别加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)，O.1mL(20μg PHA)(GFP10/ESAT6融合蛋白0.1mL(2000u)牛结核茵素(PPD/B)，O.1mL(2500u)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照)，37°C培养过夜。次日用夹心ELIsA法检测各刺激组0.1ml培养上清的IFN-γ，以OD630表示IFN-γ浓度。结果，特异性抗原CFP1O/EAAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性，相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性，相关系数为-O.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应，发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值，牛PPD检出阳性牛21头，CFP10/ESAT6检测20头，牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头，禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后，牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明，牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核茵与环境分枝杆菌混合感染时，应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低，混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。

摘要： 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应，探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每1mL全血与1ml RPMI 1640完全培养基，并分别加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)，O.1mL(20μg PHA)(GFP10/ESAT6融合蛋白0.1mL(2000u)牛结核茵素(PPD/B)，O.1mL(2500u)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照)，37°C培养过夜。次日用夹心ELIsA法检测各刺激组0.1ml培养上清的IFN-γ，以OD630表示IFN-γ浓度。结果，特异性抗原CFP1O/EAAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性，相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性，相关系数为-O.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应，发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值，牛PPD检出阳性牛21头，CFP10/ESAT6检测20头，牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头，禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后，牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明，牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核茵与环境分枝杆菌混合感染时，应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低，混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。

摘要： 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应，探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每1mL全血与1ml RPMI 1640完全培养基，并分别加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)，O.1mL(20μg PHA)(GFP10/ESAT6融合蛋白0.1mL(2000u)牛结核茵素(PPD/B)，O.1mL(2500u)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照)，37°C培养过夜。次日用夹心ELIsA法检测各刺激组0.1ml培养上清的IFN-γ，以OD630表示IFN-γ浓度。结果，特异性抗原CFP1O/EAAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性，相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性，相关系数为-O.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应，发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值，牛PPD检出阳性牛21头，CFP10/ESAT6检测20头，牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头，禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后，牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明，牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核茵与环境分枝杆菌混合感染时，应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低，混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。

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摘要： 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应，探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每1mL全血与1ml RPMI 1640完全培养基，并分别加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)，O.1mL(20μg PHA)(GFP10/ESAT6融合蛋白0.1mL(2000u)牛结核茵素(PPD/B)，O.1mL(2500u)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照)，37°C培养过夜。次日用夹心ELIsA法检测各刺激组0.1ml培养上清的IFN-γ，以OD630表示IFN-γ浓度。结果，特异性抗原CFP1O/EAAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性，相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性，相关系数为-O.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应，发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值，牛PPD检出阳性牛21头，CFP10/ESAT6检测20头，牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头，禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后，牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明，牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核茵与环境分枝杆菌混合感染时，应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低，混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。

摘要： 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应，探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每1mL全血与1ml RPMI 1640完全培养基，并分别加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)，O.1mL(20μg PHA)(GFP10/ESAT6融合蛋白0.1mL(2000u)牛结核茵素(PPD/B)，O.1mL(2500u)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照)，37°C培养过夜。次日用夹心ELIsA法检测各刺激组0.1ml培养上清的IFN-γ，以OD630表示IFN-γ浓度。结果，特异性抗原CFP1O/EAAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性，相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性，相关系数为-O.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应，发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值，牛PPD检出阳性牛21头，CFP10/ESAT6检测20头，牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头，禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后，牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明，牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核茵与环境分枝杆菌混合感染时，应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低，混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。

摘要： 本发明提供一种纳米复合材料，为聚乙烯亚胺(PEI)功能化的氮掺杂石墨烯(NG)修饰HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF纳米材料，使用该纳米复合材料制备ESAT‑6电化学适体传感器，用于ESAT‑6的定量检测。本发明通过装载电活性物质甲苯胺蓝(Tb)后最终形成的PEI@NG@HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF@Tb纳米复合材料作为传感器的敏感界面；利用PEI@NG具有良好的导电性进行信号放大作用，双MOF材料即HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF具有多孔隙率、比表面积大及优异的生物活性，与适配体之间通过氢键，π‑π堆积和静电相互作用进而负载大量适配体，最后通过适体与不同浓度目标物的特异性结合引起Tb信号响应变化，来实现对ESAT‑6的定量检测。本发明所制备的电化学适体传感器成功用于ESAT‑6的超灵敏检测。

摘要： 本发明公开了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本发明提供了一种CFP10‑ESAT6重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组融合蛋白表达量高且为上清表达、活性好；纯化该重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，制备得到了结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6；该方法制备得到的ESAT6蛋白的表达量高、抗原性好、活性好、纯度高，解决了ESAT6蛋白抗原性较差、可溶性不好、原核表达大部分为包涵体的问题，为结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗早期分泌抗原靶6（ESAT6）单克隆抗体的杂交瘤细胞株8G4、单克隆抗体MAb 8G4及其应用。所述结核分枝杆菌ESAT6单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。该单克隆抗体MAb 8G4具有效价高、特异性好的优势，基于此建立的竞争ELISA检测试剂盒方法具有良好的灵敏度和特异性，可同时检测针对多种宿主的结核分枝杆菌复合群感染引起的结核病，操作简便，具有应用于结核病检测的价值。

摘要： 本发明公开了一种重组结核杆菌ESAT6‑CFP10融合蛋白，氨基酸序列SEQ ID NO.1，其是通过大肠杆菌表达系统进行原核表达和纯化得到。本发明还公开了该重组结核杆菌ESAT6‑CFP10融合蛋白的制备方法，其包括ESAT6‑CFP10融合蛋白表达菌株的构建以及ESAT6‑CFP10融合蛋白的表达与纯化。本发明将蛋白ESAT6和CFP10融合在一起，通过原核表达系统表达了重组蛋白ESAT6‑CFP10，该重组蛋白可用于结核菌潜伏感染人群的筛查以及结核病的辅助诊断，克服了通用的特异性γ‑IFN检测方法价格昂贵、设备及操作人员要求高的缺点，使用方便、易于推广、适合于大规模普及。

摘要： 本发明提供一种纳米复合材料，为聚乙烯亚胺(PEI)功能化的氮掺杂石墨烯(NG)修饰HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF纳米材料，使用该纳米复合材料制备ESAT‑6电化学适体传感器，用于ESAT‑6的定量检测。本发明通过装载电活性物质甲苯胺蓝(Tb)后最终形成的PEI@NG@HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF@Tb纳米复合材料作为传感器的敏感界面；利用PEI@NG具有良好的导电性进行信号放大作用，双MOF材料即HP‑Uio‑66‑NH2‑on‑Ce‑MOF具有多孔隙率、比表面积大及优异的生物活性，与适配体之间通过氢键，π‑π堆积和静电相互作用进而负载大量适配体，最后通过适体与不同浓度目标物的特异性结合引起Tb信号响应变化，来实现对ESAT‑6的定量检测。本发明所制备的电化学适体传感器成功用于ESAT‑6的超灵敏检测。

摘要： 本发明涉及一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体；一种用于诊断结核的生物传感器，其包括所述DNA适体；以及一种用于提供用于诊断结核的信息的方法。本发明人发现，根据本发明的DNA适体不仅具有与ESAT6蛋白的特异性结合潜能，而且结合亲和力也优异。因此可以预期，本发明的DNA适体在使用时比使用抗体的常规ELISA方法表现出更大的稳定性。因此，该适体预期有益地应用于开发用于诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器以及用于提供用于诊断结核的信息的方法。

摘要： 本发明公开了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本发明提供了一种CFP10‑ESAT6重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组融合蛋白表达量高且为上清表达、活性好；纯化该重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，制备得到了结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6；该方法制备得到的ESAT6蛋白的表达量高、抗原性好、活性好、纯度高，解决了ESAT6蛋白抗原性较差、可溶性不好、原核表达大部分为包涵体的问题，为结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗早期分泌抗原靶6（ESAT6）单克隆抗体的杂交瘤细胞株8G4、单克隆抗体MAb 8G4及其应用。所述结核分枝杆菌ESAT6单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。该单克隆抗体MAb 8G4具有效价高、特异性好的优势，基于此建立的竞争ELISA检测试剂盒方法具有良好的灵敏度和特异性，可同时检测针对多种宿主的结核分枝杆菌复合群感染引起的结核病，操作简便，具有应用于结核病检测的价值。

摘要： 本发明公开了一种基于酶联免疫斑点试验试剂盒计算ESAT‑6抗原孔平均斑点面积的方法，该方法首先将收集待测的外周血单个核细胞悬液加入包被有IFN‑γ抗体的微孔培养板内；并向待测的外周血单个核细胞悬液中加入ESAT‑6蛋白液培养，再向对应的微孔内加入IFN‑γ抗体酶标工作液孵育；每孔加入底物室温避光孵育、干燥；使用斑点计数仪计算微孔板内斑点形成细胞的平均斑点面积；本发明的方法通过ELISPOT技术检测结核特异性抗原ESAT‑6刺激条件下外周血单个核细胞释放IFN‑γ并通过显色形成的斑点的平均斑点面积，从而指导医生对活动性结核患者和潜伏性结核患者进行鉴别诊断。

摘要： 本发明涉及结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT‑6单抗的重链和轻链可变区基因和编码的多肽及其应用。采用原核表达系统获得结核分枝杆菌毒株H37Rv Rv3875编码的ESAT‑6重组蛋白；重组蛋白免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选并获得可持续分泌抗ESAT‑6抗体的杂交瘤细胞系，命名为B1C8。单克隆抗体B1C8可特异识别结核分枝杆菌毒株H37Rv的ESAT‑6，而与其他细菌蛋白无交叉反应。因此，所述的单克隆抗体B1C8重链和轻链可变区基因及编码的多肽可用于结核分枝杆菌感染的诊断、试剂、疫苗和药物的研制，具有比较好的应用前景。