聚合酶链反应-限制性片段长度多态性

摘要： 目的 探讨HOTAIR基因rs920778、rs4759314、rs1899663多态性位点与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)易感性的关系.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法对200例CRC患者和200例健康人对照组HOTAIR基因rs920778、rs4759314和rs1899663多态性位点进行基因分型,并通过SHEsis在线软件构建单倍型.结果 rs1899663基因型频率在病例组和健康人对照组间差异有统计学意义(P=0.009).与GG基因型相比,该位点TT基因型携带者与CRC发病风险降低相关(OR=0.36,95％CI:0.15～0.84,P=0.019),而GT/TT基因型携带者与CRC的风险降低亦存在相关性(OR=0.56,95％CI:0.37～0.85,P=0.006).结论 HOTAIR基因rs1899663位点的T等位基因与CRC的发生率降低相关,rs920778和rs4759314位点的多态性与CRC的遗传易感性无关.

摘要： Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii were familiar opportunistic pathogens for fish.The discrimination of them using traditionary method such as morphological classification and physiological-bio-chemical identification was time-consuming and needed great energy,and they might result in erroneous i-dentification sometimes.In order to improve efficiency and accuracy,it was necessary to establish a molecu-lar biology method for rapid discrimination of them.Universal primer was used to amplify 1 6 S rDNA gene of 12 aeromonads isolated from diseased fish,and sequences acquired were applied to build phylogenetic tree to validate species of aeromonads.Suitable restriction endonucleases were chosen based on the different sequences between species,and PCR-RFLP analysis was utilized to discriminate the above two Aeromonas spp.Through experiments,SnaBⅠ was chosen to digest 1 6 S rDNA of A.hydrophila specifically and BseNⅠ was chosen to discriminate A.veronii from A.hydrophila quickly.A PCR-RFLP method was estab-lished to rapid discrimination of A.hydrophila and A.veronii and it was of a certain reference significance and application value for the rapid discrimination of A.hydrophila and A.veronii in the bacterial diseases of freshwater fish.%嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌是鱼类常见条件致病菌,采用传统的形态分类和生理生化反应进行鉴别费时费力,有时还会错误判断,为了提高鉴别效率和准确率,有必要建立一种快速鉴别两种细菌的分子生物学方法.选取12株鱼源致病气单胞菌使用细菌16 S rDNA通用引物扩增细菌目的片段,将所测得序列校正后构建系统发育树以明确菌种,并依据种间序列差异筛选合适的限制性核酸内切酶,对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌进行PCR-RFLP酶切图谱的鉴别分析.筛选出嗜水气单胞菌16 S rDNA的特异性限制性核酸内切酶SnaBⅠ和可以鉴别维氏气单胞菌的限制性核酸内切酶BseNⅠ,建立了一种快速鉴别嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的PCR-RFLP方法.研究结果对于淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌细菌性病害的病原快速鉴别具有参考和应用价值.

摘要： 目的 探讨昆明地区汉族人群维生素D受体基因多态性与2型糖尿病的相关性.方法 选取昆明地区汉族2型糖尿病患者(DM组)90例及健康对照(NC组)36例.运用PCR-FRLP技术测定维生素D受体ApaI基因多态性,比较各组基因型及等位基因频率及不同基因型间相关临床资料.结果 (1)2型糖尿病组与正常组间维生素D受体Apal基因存在多态性,2型糖尿病组中C/A基因型分布频率明显高于正常对照组(x 2=53.432,P＜0.001);(2)2型糖尿病组的年龄、FPG、LDL-C高于正常对照组,25-OHD3、Ca低于正常对照组(P＜0.05);糖尿病组A/A基因型Scr显著高于其他组别,差异有统计学意义(P＜0.05);3组基因型间UA均存在统计学差异(P＜0.05),且C/A基因型最高;(3)二分类Logistic回归分析结果提示ApaI C/A基因型(OR=1.36,95％CI;0.54-1.71)、年龄(OR=1.09,95％ CI:1.03-1.18)为2型糖尿病的危险因素,而25-OHD3 (OR=0.84,95％CI:0.73～0.93)可能是T2DM的发生的保护因素.结论 (1)昆明地中VDR ApaI位点C/A基因型与T2DM的发生存在相关性;(3) 25-0HD3是T2DM的发生的保护因素,增龄是2型糖尿病的危险因素.

摘要： 目的探讨昆明地区汉族人群维生素D受体基因多态性与2型糖尿病的相关性.方法选取昆明地区汉族2型糖尿病患者（DM组）90例及健康对照（NC组）36例.运用PCR-FRLP技术测定维生素D受体Apa I基因多态性,比较各组基因型及等位基因频率及不同基因型间相关临床资料.结果 （1）2型糖尿病组与正常组间维生素D受体Apal基因存在多态性,2型糖尿病组中C/A基因型分布频率明显高于正常对照组（χ2=53.432,P〈0.001）;（2）2型糖尿病组的年龄、FPG、LDL-C高于正常对照组,25-OHD3、Ca低于正常对照组（P〈0.05）;糖尿病组A/A基因型Scr显著高于其他组别,差异有统计学意义（P〈0.05）;3组基因型间UA均存在统计学差异（P〈0.05）,且C/A基因型最高;（3）二分类Logistic回归分析结果提示Apa I C/A基因型（OR=1.36,95%CI：0.54-1.71）、年龄（OR=1.09,95%CI：1.03-1.18）为2型糖尿病的危险因素,而25-OHD3（OR=0.84,95%CI：0.73～0.93）可能是T2DM的发生的保护因素.结论 （1）昆明地中VDR Apa I位点C/A基因型与T2DM的发生存在相关性;（3）25-OHD3是T2DM的发生的保护因素,增龄是2型糖尿病的危险因素.

摘要： Objective To investigate the optimum experimental condition of polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphisms (PCR-EFLP) in detection of polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894T. Methods Research was made on influencing factors of PCR and RFLP. Results The optimum experimental conditions for PCR in amplification of eNOS gene included primer concentration as 20μmol/L, Taq enzyme amount as 5.0 U, and dNTP concentration as 112μmol/L. 4μl products in 20μl system under 4 h of 5.0 U enzymic digestion was the most financial enzymatic system. Conclusion Investigation of the optimum experimental condition is the key to implement large quantities of experiments.%目的：探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS) G894T多态性的最佳实验条件。方法对PCR和RFLP的一些影响因素进行研究。结果 PCR扩增eNOS基因的最佳条件为：20μmol/L的引物浓度；5.0 U的Taq酶量；112μmol/L的dNTP浓度。20μl体系中加4μl产物,5.0 U的酶消化4 h为最经济有效的酶切体系。结论最佳的实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键。

摘要： 目的 运用PCR-RFLP快速准确鉴定临床常见致病性念珠菌.方法 收集四川省人民医院2008年11月～12月临床分离的念珠菌169例,提取念珠菌DNA,采用PCR扩增核糖体DNA内部转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2),扩增产物运用Sty I和MspI酶切分析,确定临床常见致病性念珠菌种类.结果 白色念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌均扩增出长度约500 bp的DNA片段,光滑念珠菌扩增出长度约881 bp的DNA片段.扩增产物经Msp I酶切后产生四种不同的带型,其中白色念珠菌和都柏林念珠菌带型一致.将白色念珠菌和都柏林念珠菌用Sty I酶切进行鉴定.PCR-RFLP分析显示,169株临床分离念珠菌中,111株为白色念珠菌,32株为热带念珠菌,19株为光滑念珠菌,7株为克柔念珠菌.结论 PCR-RFLP方法能准确快速检测和鉴定出临床常见的致病性念珠菌,为念珠菌病分子诊断奠定了基础.

摘要： 探讨中国黑龙江汉族人群核苷酸内焦磷酸酶磷酸二酯酶1(Ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1)基因第4外显子K121Q对糖尿病发病的影响及其两者之间的关系.运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测146例2型糖尿病 (T2DM)患者(T2DM组)和238例糖耐量正常对照健康人(对照组)ENPP1基因K121Q的多态性分布,同时检测其临床及生化指标,进行随机对照研究.①T2DM组XQ(KQ+QQ)基因型频率高于对照组(21.23% vs 10.50%,P = 0.0038),其Q等位基因频率亦高于对照组(10.96% vs 5.25%,P = 0.0034),差异有统计学意义;②携带Q等位基因个体与携带K等位基因个体两组比较,在性别构成、年龄、身高、体重、体重指数(BMI)1、腰围、臀围、腰臀比(WHR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素水平(FINS)、HOMA-IR差异均无统计学意义(P ＞ 0.05);③Logistic回归显示,ENPP1基因K121Q多态性与T2DM相关(OR = 2.30,95%CI=1.29~4.08,P = 0.0038);④汉族人群Q等位基因携带频率低于其他人群(非西班牙裔白人、美国黑人和西班牙人).①ENPP1基因K121Q位点Q等位基因与中国黑龙江省汉族人群T2DM发病相关;②T2DM患者中携带Q等位基因个体无明显胰岛素抵抗表现;③ENPP1基因K121Q位点的多态性有明显种族地域差异性.

摘要： 目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件。方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究。结果 PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为：引物浓度为30umol/L；Taq酶量为5U；dNTP浓度为56μmol/L。最经济有效的酶切体系为20μl体系中加4μl产物用5U的酶消化9h。结论最佳的实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键。

摘要： 本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别道地(河南、山东)与非道地(其他产区)产区金银花的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR-RFLP)。道地产区金银花的特征DNA碱基序列为：5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G-3’；限制性内切酶EcoN I及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下：提取药材DNA；用一对引物进行PCR扩增；用限制性内切酶EcoN I或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与道地性金银花PCR-RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否为道地性金银花药材。

摘要： 本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别川贝母与非川贝母类药材的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR-RFLP)。PCR扩增所用引物序列为：P1：5’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGTGAA-3’，P2：5’-GCT ACG TTC TTC ATC GAT-3’；川贝母的特征DNA碱基序列为：5’-TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC-3’；限制性内切酶Sma I及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下：提取药材DNA；用引物P1、P2进行PCR扩增；用限制性内切酶Sma I或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与川贝母PCR-RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否川贝母药材。

摘要： 本发明公开了一种用于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法，以家蚕个体为研究对象，解剖后取后部丝腺；加入液氮后经充分研磨后，充分酶解后，用酚进行抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀；RNase处理后，经酚、氯仿抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀。严格控制实验环节，每头家蚕可抽提高纯度DNA(OD260/280＞1.9)200μg，可用于200次RFLP检测。该发明解决了目前以家蚕为材料的RFLP研究DNA纯度不高和抽提的DNA量过少的问题。

摘要： 本发明公开了一种利用扩增DNA片段长度多态性测定短链RNA的方法，属于分子生物技术领域，包括以下步骤：首先利用至少两种与待测短链RNA相比无天然同源序列的合成小RNA作为测定的内标，将这些合成小RNA以不同分子数混合，形成动态小RNA标准分子梯度；再以等量的所述动态小RNA标准与所述待测短链RNA混合，经由RNA反转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR产物DNA长度多态性片段的荧光定量分析，测得所述待测短链RNA扩增产生的DNA片段荧光强度在所述动态小RNA标准荧光强度梯度上的相对比例，本方法可以实现对短链RNA尤其是miRNA的绝对定量，且具有高特异性、高灵敏度、结果客观、重复性好，可在100-106拷贝数范围内准确定量，也适用于RNA粗提物。

摘要： 本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别道地（河南、山东）与非道地（其他产区）产区金银花的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法（PCR－RFLP）。道地产区金银花的特征DNA碱基序列为：5′－GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G－3’；限制性内切酶EcoNI及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下：提取药材DNA：用一对引物进行PCR扩增；用限制性内切酶EcoNI或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与道地性金银花PCR─RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否为道地性金银花药材。

摘要： 本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别川贝母与非川贝母类药材的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR－RFLP)。PCR扩增所用引物序列为：P1：5’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGTGAA－3’，P2：5’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；川贝母的特征DNA碱基序列为：5’－TGCCCGCCCTGCCCGGGACC TCGC－3’；限制性内切酶Sma I及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下：提取药材DNA；用引物P1、P2进行PCR扩增；用限制性内切酶Sma I或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与川贝母PCR－RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否川贝母药材。

摘要： 本发明涉及一种快速导出末端限制性片段长度多态数据的方法，包含有以下几个步骤：第一步、统计分析原始T‑RFLP数据;第二步、数据的导出和保存;第三步、数据的R统计语言进行数据合并和计算。与常规的利用Genemapper软件处理数据相比较，本方法更加快速，可以实现批量处理与导出数据，减少人工挑选图谱的误差。

摘要： 本发明公开了一种用于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法，以家蚕个体为研究对象，解剖后取后部丝腺；加入液氮后经充分研磨后，充分酶解后，用酚进行抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀；RNase处理后，经酚、氯仿抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀。严格控制实验环节，每头家蚕可抽提高纯度DNA(OD260/280＞1.9)200μg，可用于200次RFLP检测。该发明解决了目前以家蚕为材料的RFLP研究DNA纯度不高和抽提的DNA量过少的问题。

摘要： 本发明公开了一种基于片段长度多态性PCR的中药桃仁的鉴定方法，具体包括以下步骤：(1)准备好所需的原材料以及反应试剂；(2)提取步骤(1)中原材料的基因组DNA；(3)将基因组DNA、引物1、引物2、水和反应试剂构成PCR反应体系，在梯度PCR仪上，进行预变性、变性、退火、延伸、再延伸四个步骤循环若干次；(4)引物设计与筛选：从GeneBank数据库中搜集原材料基原植物或/和同属近缘种基原植物的叶绿体petA‑psbJ序列；进行序列比对后设计片段长度多态性PCR引物；将设计好的引物经过步骤(3)PCR扩增后，依据种间特异性、种内通用性原则筛选出鉴定引物；(5)PCR鉴定：经过筛选得出PCR鉴定引物为TR1和TR2；(6)PCR产物的纯化、克隆与测序。

摘要： 本发明公开了一种利用扩增DNA片段长度多态性测定短链RNA的方法，属于分子生物技术领域，包括以下步骤：首先利用至少两种与待测短链RNA相比无天然同源序列的合成小RNA作为测定的内标，将这些合成小RNA以不同分子数混合，形成动态小RNA标准分子梯度；再以等量的所述动态小RNA标准与所述待测短链RNA混合，经由RNA反转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR产物DNA长度多态性片段的荧光定量分析，测得所述待测短链RNA扩增产生的DNA片段荧光强度在所述动态小RNA标准荧光强度梯度上的相对比例，本方法可以实现对短链RNA尤其是miRNA的绝对定量，且具有高特异性、高灵敏度、结果客观、重复性好，可在100-106拷贝数范围内准确定量，也适用于RNA粗提物。