一种用于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法

摘要

本发明公开了一种用于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法，以家蚕个体为研究对象，解剖后取后部丝腺；加入液氮后经充分研磨后，充分酶解后，用酚进行抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀；RNase处理后，经酚、氯仿抽提后，用正丁醇浓缩后用乙醇进行沉淀。严格控制实验环节，每头家蚕可抽提高纯度DNA(OD260/280＞1.9)200μg，可用于200次RFLP检测。该发明解决了目前以家蚕为材料的RFLP研究DNA纯度不高和抽提的DNA量过少的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕DNA的抽提方法，具体涉及到一种适合于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法。

背景技术

限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。这一技术的开展需要以个体作为研究对象，即需要抽提出个体内高纯度和高浓度的DNA，用于RFLP的相关研究。

家蚕(Bombyx mori L.)是重要的经济昆虫，也是用于遗传学及分子生物学研究的模式昆虫。现有技术中，提取家蚕的DNA用于RFLP研究的技术主要有以下几种：

(1)常规的DNA抽提方法：是将家蚕整头一起进行研磨。

由于蚕体含有大量蛋白、脂类及色素，抽提出的DNA纯度较低(OD_260/280＜1.8)，进行RFLP检测时，限制性酶切往往切不彻底，不能进行RFLP研究。

(2)将多头家蚕的后部丝腺混在一起进行DNA抽提。

虽然DNA的量是达到了RFLP研究的要求，但RFLP的研究需要DNA样品来源于个体而不是群体。

(3)目前国内有些实验室也尝试从家蚕个体后部丝腺抽提DNA做RFLP，但由于传统的抽提方法在抽提过程DNA损失量过大，只有10μg左右，不能对结果进行重复试验，DNA的样就用完了。

要开展对个体作为研究对象的RFLP检测，需要优化DNA的抽提方法，抽提出高质量(OD_260/280＞1.9)的足够多(100μg以上)的DNA样品。

发明内容

本发明目的是提供一种适合于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法，该方法能够抽提出高质量，高纯度的家蚕DNA样品用于RFLP研究。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种适合于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提的方法，包括解剖家蚕取出后部丝腺，从家蚕个体的后部丝腺抽提DNA，再采用RNase酶消解RNA，所述解剖家蚕取出后部丝腺的具体步骤为：在无菌条件下解剖家蚕，取后部丝腺，经磷酸盐缓冲液冲洗，将后部丝腺研磨至粉末；其中，从后部丝腺抽提DNA和采用RNase酶消解RNA的具体步骤为：

(1)采用DNA酶解缓冲液融化后部丝腺粉末，混匀后将溶液于48～55℃水浴裂解6～8小时；

(2)加入与步骤(1)中溶液等体积的饱和酚，混匀后离心，取上清液；取与上清液等体积的正丁醇与上清液混匀，离心后弃上清液，重复离心弃上清液的过程至少1次，浓缩至0.1ml以下；采用无水乙醇和醋酸钠析出DNA，然后用TE缓冲液溶解DNA，混匀后至少放置0.5小时；

(3)于35～39℃水浴中，采用RNase酶处理步骤(2)中的DNA溶液，消解去除RNA；加入与DNA溶液等体积的饱和酚，混匀后离心，除去下层的酚层，再加入同样体积的饱和酚，混匀后离心，取上清液；

(4)取与步骤(3)中的饱和酚等体积的酚氯仿，与步骤(3)所得的上清液混匀后离心，再取上清液，并取与之等体积的正丁醇混合均匀，离心后弃上清，重复离心弃上清的过程至少1次，浓缩至0.1ml以下；采用无水乙醇和醋酸钠析出DNA，用70～75％的乙醇洗涤，溶解于TE缓冲液中。

上述技术方案中，所述磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的成分和浓度为：

氯化钠NaCl           137mmol/L，

氯化钾KCl            2.7mmol/L，

磷酸氢二钠Na₂HPO₄    4.3mmol/L，

磷酸二氢钾KH₂PO₄     1.4mmol/L；

所述DNA酶解缓冲液的组分和浓度为：

蛋白酶K              0.2 mg/ml，

十二烷基硫酸钠SDS    0.5％(重量比)，

四乙酸二氨基乙烯EDTA     0.05M；

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它具有很高的比活性，可以用于生物样品中蛋白质的一般降解；螯合剂EDTA等或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该酶在较广的pH范围内(pH 4～12.5)均有活性；上述方案中的DNA酶解缓冲液需要现配现用。

上述技术方案中，所述TE缓冲液的配置方法为：在800ml水中依次加入10ml的1mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，2ml的0.5mol/L的EDTA(pH 8.0)，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

上述技术方案中，所述混合操作使用的仪器为DNA混匀仪，转速为10rpm/min，混合时间为10～30min；所述离心操作的转速为4000～12000rpm/min，操作温度为4℃，离心时间为10min。

上述技术方案中，步骤(1)为DNA酶解过程，加入的DNA酶解缓冲液的量为5ml，步骤(1)过程中每一个小时上下颠倒5～8次混匀样品。

上述技术方案中，步骤(2)中用于析出DNA的无水乙醇和醋酸钠为2.5ml的-20℃的冰冻无水乙醇和0.1ml的3mol/L的醋酸钠；用于溶解DNA的TE缓冲液为1.2ml；步骤(2)完成，即DNA抽提完成后，不能立即进行RNase处理时，需要放置0.5小时以上。

上述技术方案中，步骤(3)中采用RNase酶消解RNA时，于37℃水浴1小时；RNase的浓度为10mg/mL，RNase的量为1μL。

上述技术方案中，步骤(4)中所述酚氯仿中酚和氯仿的体积比为1∶1；用于析出DNA的无水乙醇和醋酸钠为0.25ml的-20℃的冰冻无水乙醇和10μL的3mol/L的醋酸钠。步骤(4)完成后，将DNA样品置于-20℃下保存，可长期保存；最后DNA样品的浓度可通过测定OD₂₆₀进行计算。

上述技术方案中，所述的酚(分子式：C₆H₆O，MW：94.11)都是Tris饱和酚(在酚中加了抗氧化剂8-羟基喹啉)。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明选取的材料是个体家蚕的后部丝腺，抽提出的DNA既具有个体代表性，DNA的纯度高(OD_260/280＞1.9)；

2.本发明在DNA抽提过程中，严格控制减少DNA的损失量，抽出的DNA量可达200μg，可用于RFLP检测200次。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种适合于RFLP研究的家蚕DNA抽提方法：

(1)解剖器材的准备，包括，

医用镊子(12.5cm)、解剖刀(12号)、培养皿(9cm)、离心管(15mL)、移液器及Tip头、Eppendorf管(1.5mL)。

(2)试剂的配制

DNA酶解缓冲液(0.2mg/mL蛋白酶K，0.5％SDS，0.05M EDTA)

PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)

TE缓冲液(在800mL水中依次加入1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)2mL，加水定容至1L，分装后高压灭菌。)

(3)解剖

在超净工作台内，将经72％乙醇消毒5分钟的5龄第5天家蚕解剖，取后部丝腺经无菌PBS缓冲液冲洗后，放入已灭菌的研钵内。

(4)DNA抽提

加入液氮至研钵容量的2/3，快速研磨至粉末。在研钵内加入配制好的DNA裂解缓冲液5mL，完全融化后将混合液转移至15mL离心管，上下颠倒5～8次混匀，置50℃水浴裂解6～8h。

加入等体积饱和酚，经DNA混匀仪混匀(10rpm/min)30min后，12000rpm/min 4℃离心10min后，将上清转移至另一新离心管中。

加入等体积的正丁醇后，经DNA混匀仪混匀(10rpm/min)10min后，4000rpm/min 4℃离心10min，弃上清，重复3次浓缩体系到1mL以下。

加入2.5mL冰冻(-20℃)的无水乙醇和0.1mL 3M NaAc后，用玻璃棒钩出絮状DNA沉淀，溶于1.2mlTE缓冲液，经DNA混匀仪混匀(10rpm/min)1h后进行RNA酶(RNase)处理。

(5)RNase处理

将1.2mL DNA溶液分成两个1.5mL的Eppendorf管(各0.6mL)。加入RNase(10mg/mL)1μL后，37℃水浴1h。

加入0.6mL饱和酚，经DNA混匀仪混匀(10rpm/min)30min后，12000rpm/min 4℃离心10min后，吸去下层酚，再加入0.6mL饱和酚重复一次，取上清转移至新的Eppendorf管。

加入新配的酚氯仿(体积比为1∶1)混合液0.6mL，经DNA混匀仪混匀(10rpm/min)30min后，12000rpm/min 4℃离心10min后，取上清转移至新的Eppendorf管。

加入等体积的正丁醇后，经DNA混匀仪混匀10min后，4000rpm/min 4℃离心10min，弃上清，重复3次至体系到0.1mL以下。

加入0.25mL冰冻的无水乙醇和10μL 3M NaAc后，用力震荡Eppendorf管，使DNA析出，玻璃钩钩出DNA沉淀，经70％乙醇洗盐两次后，溶于0.2mL TE，-20℃保存备用。

(6)DNA的样品浓度通过测定OD₂₆₀进行计算，计算公式如下：

DNA浓度(μg/ml)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000

当OD₂₆₀＝1.0

稀释倍数＝4000倍时

DNA浓度(μg/ml)＝200μg/ml

本发明选用最适合于DNA抽提的组织、采用的抽提方法科学、合理，减少在抽提过程中DNA的损失，可从每头蚕体抽提出高纯度(OD_260/280＞1.9)DNA 200μg，可用于RFLP检测200次，解决了目前以家蚕为材料的RFLP研究DNA质量不高和抽提的DNA量过少的问题。