小鼠,基因敲除

摘要： 目的 探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因敲除的小鼠模型,为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础.方法 根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选,通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版,得到4个上游引物.随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选,筛选切割有效的sgRNA,从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验.运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板,接着体外转录Cas9mRNA.将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA 一起注射入健康的C57BL//6小鼠受精卵内,剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定.选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠,结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况.选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠,剪取鼠尾组织并测序,最终得到F2代纯合子敲基因小鼠.运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序,通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合,同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失.结果 经 PCR扩增得到上游引物 sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F 与下游引物sgRNAprimer-R.经过sgRNA的体外转录和筛选,sgRNA-1,sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高,被选取用于后续实验.将T7promoter添加到Cas9mRNA的5'端,运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA.把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养.把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部,并成功获得F0代小鼠.通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只.将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后,结合PCR与测序比对,共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只.将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交,得到F2代小鼠.通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察,证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列,电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带,鉴定为纯合子;得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育,结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型.结论 成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型,稳定性强,可重复性高,为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础.

摘要： 目的探讨卵巢肿瘤结构域蛋白3敲除(OTUD3^(-/-))小鼠黑质核因子κB(NF-κB)相关炎症因子表达的变化及其机制。方法分别选取3只24月龄OTUD3^(-/-)雄性小鼠(OTUD3^(-/-)组)及其同窝野生型(WT)雄性小鼠(WT组)的双侧黑质组织,采用转录组学测序(RNA-seq)技术筛选差异表达基因(DEGs),应用KEGG通路富集分析先天免疫应答中NF-κB相关炎症因子表达变化,并采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对筛选出的DEGs进行验证。结果KEGG通路富集分析显示,与WT组小鼠相比,OTUD3^(-/-)组小鼠黑质NF-κB经典通路上的脂多糖结合蛋白(LBP)和环氧合酶2(COX2)表达上调,非经典通路上的C-C基序趋化因子19(CCL19)和细胞黏附因子1(ICAM1)表达也均上调。RT-qPCR验证结果显示,与WT组相比,OTUD3^(-/-)组小鼠黑质LBP和COX2 mRNA水平明显上调(t=7.81、3.11,P<0.05)。结论OTUD3^(-/-)小鼠黑质区可能通过上调NF-κB相关炎症因子LBP、COX2、CCL19和ICAM1基因的表达水平,参与神经炎症反应的调控。

摘要： 目的 探讨卵巢肿瘤结构域蛋白3敲除(OTUD3-/-)小鼠黑质核因子κB(NF-κB)相关炎症因子表达的变化及其机制.方法 分别选取3只24月龄OTUD3-/-雄性小鼠(OTUD3-/-组)及其同窝野生型(WT)雄性小鼠(WT组)的双侧黑质组织,采用转录组学测序(RNA-seq)技术筛选差异表达基因(DEGs),应用KEGG通路富集分析先天免疫应答中NF-κB相关炎症因子表达变化,并采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对筛选出的DEGs进行验证.结果 KEGG通路富集分析显示,与WT组小鼠相比,OTUD3-/-组小鼠黑质NF-κB经典通路上的脂多糖结合蛋白(LBP)和环氧合酶2(COX2)表达上调,非经典通路上的C-C基序趋化因子19(CCL19)和细胞黏附因子1(ICAM1)表达也均上调.RT-qPCR验证结果显示,与WT组相比,OTUD3-/-组小鼠黑质LBP和COX2 mRNA水平明显上调(t=7.81、3.11,P<0.05).结论 OTUD3-/-小鼠黑质区可能通过上调NF-κB相关炎症因子LBP、COX2、CCL19和ICAM1基因的表达水平,参与神经炎症反应的调控.

摘要： 目的 系统评价表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对于2型糖尿病db/db小鼠伤口愈合的治疗效果.方法 3月龄雄性无特定病原体(SPF)级db/db小鼠共32只以及同背景的野生型雄性小鼠共16只用于本实验,共等分为野生小鼠组(Control)、db/db小鼠组(db/db)和db/db小鼠EGCG治疗组(db/db+EGCG),每组16只.所有小鼠均构建背部圆形创口(直径1 cm),db/db+EGCG组小鼠在伤口模型构建后立即施以每日的EGCG(10 mg/kg)灌胃处理.术后第5、12、19天处死每组4只小鼠,分析伤口愈合速率、抗张强度、局部皮肤血流速率、细胞因子表达情况.结果 db/db+EGCG组小鼠在伤口模型建立的第5、12、19天伤口愈合率分别为(19.4±3.2)％、(55.2±4.8)％和(79.7±5.2)％,db/db组小鼠各时间点伤口愈合率分别为(10.1±2.0)％、(39.1±5.2)％和(59.2±6.2)％,db/db+EGCG组均显著高于db/db组(P<0.05),同时EGCG也显著降低了db/db小鼠伤口愈合时间(P<0.05);并且EGCG在术后第5、12、19天均显著增加了db/db小鼠伤口组织的生物力学抗张强度(P<0.05),改善了伤口位置局部血流速率(P<0.05),并显著抑制了炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子 α(TNF-α)表达(P<0.05),促进了血管内皮生长因子(VEGF)表达(P<0.05).结论 EGCG能够显著改善2型糖尿病db/db小鼠的伤口愈合能力,具有可观的临床应用前景.

摘要： 目的:探讨钙结合蛋白S100A4调节小鼠骨髓源肥大细胞(BMMC)活化的作用.方法:8～10周龄野生型(WT)和S100A4基因敲除(S100A4-/-)C57BL/6健康雄性小鼠各2只,取胫骨与股骨提取骨髓进行骨髓源肥大细胞(BMMC)培养并鉴定;以成熟WT BMMC为模型细胞,实验分为S100A4蛋白处理组(1500μg/L S100A4蛋白)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(S100A4蛋白等量体积PBS),分别于培养第1、2及3周采用甲苯胺蓝染色鉴定小鼠成熟BMMC,采用化学发光法检测各组小鼠成熟BMMC中β-氨基己糖苷酶(β-hex)的吸光度(OD),采用流式细胞术检测各组小鼠成熟BMMC的S100A4蛋白表达和白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-13(IL-13)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的荧光强度并计算相对荧光指数(rFI);以成熟WT和S100A4-/-BMMC为模型细胞,实验分为WT离子霉素(ION)处理组(1500μg/L ION)、WT PBS对照组(ION等量体积PBS)、S100A4-/-ION处理组(1500μg/L ION)及S100A4-/-PBS对照组(ION等量体积PBS),采用化学发光法检测各组小鼠成熟BMMC中 β-hex的吸光度(OD).结果:BMMC培养至3周时基本成熟,并表达S100A4蛋白;S100A4蛋白处理组成熟BMMC中 β-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平高于PBS对照组(P<0.05或P<0.01);WT ION处理组成熟BMMCβ-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平高于WT PBS对照组(P<0.01),S100A4-/-ION处理组成熟BMMC中 β-hex、IL-5及IL-6明显高于S100A4-/-PBS对照组(P<0.05),S100A4-/-ION处理组成熟BMMC中β-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平均低于WT ION处理组(P<0.05).结论:S100A4蛋白能够直接诱导成熟BMMC活化,S100A4基因的缺失可抑制成熟BMMC活化及炎性因子的产生.

摘要： 目的:探讨钙结合蛋白S100A4调节小鼠骨髓源肥大细胞(BMMC)活化的作用。方法:8~10周龄野生型(WT)和S 100 A 4基因敲除(S 100 A 4-/-)C57BL/6健康雄性小鼠各2只,取胫骨与股骨提取骨髓进行骨髓源肥大细胞(BMMC)培养并鉴定;以成熟WT BMMC为模型细胞,实验分为S100A4蛋白处理组(1500μg/L S100A4蛋白)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(S100A4蛋白等量体积PBS),分别于培养第1、2及3周采用甲苯胺蓝染色鉴定小鼠成熟BMMC,采用化学发光法检测各组小鼠成熟BMMC中β-氨基己糖苷酶(β-hex)的吸光度(OD),采用流式细胞术检测各组小鼠成熟BMMC的S100A4蛋白表达和白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-13(IL-13)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的荧光强度并计算相对荧光指数(rFI);以成熟WT和S 100 A 4-/-BMMC为模型细胞,实验分为WT离子霉素(ION)处理组(1500μg/L ION)、WT PBS对照组(ION等量体积PBS)、S 100 A 4-/-ION处理组(1500μg/L ION)及S 100 A 4-/-PBS对照组(ION等量体积PBS),采用化学发光法检测各组小鼠成熟BMMC中β-hex的吸光度(OD)。结果:BMMC培养至3周时基本成熟,并表达S100A4蛋白;S100A4蛋白处理组成熟BMMC中β-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平高于PBS对照组(P<0.05或P<0.01);WT ION处理组成熟BMMCβ-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平高于WT PBS对照组(P<0.01),S 100 A 4-/-ION处理组成熟BMMC中β-hex、IL-5及IL-6明显高于S 100 A 4-/-PBS对照组(P<0.05),S 100 A 4-/-ION处理组成熟BMMC中β-hex、IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平均低于WT ION处理组(P<0.05)。结论:S100A4蛋白能够直接诱导成熟BMMC活化,S 100 A 4基因的缺失可抑制成熟BMMC活化及炎性因子的产生。

摘要： 目的 观测硬骨素基因敲除(SOST-/-)小鼠在失去雌激素作用后骨密度和骨微结构的变化.方法 12只4周龄SOST-/-小鼠,随机分2组(n=6):去卵巢组(SOV),假手术组(SSO);12只野生型小鼠随机分为2组(n=6):野生型去卵巢组(WTO),野生型假手术组(WTS).12周后处死小鼠,腰椎行显微CT扫描分析.观察比较4组小鼠骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度.结果 SOV与SSO组之间骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度差异无统计学意义(P＞0.05),SOV和SSO组骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均较WTO和WTS组显著增高,差异有统计学意义(P ＜0.001).WTO组骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量均较WTS组显著降低,差异有统计学意义(P=0.017、0.039、0.021);两组间骨小梁厚度差异无统计学意义(P=0.109).结论 硬骨素基因敲除小鼠表现为高骨量,去卵巢不会导致骨量丢失和骨微结构退变,提示硬骨素是潜在的绝经后骨质疏松治疗靶点.

摘要： 目的 探讨采用Cre-LoxP技术构建肝脏特异性HIF-2α 基因敲除小鼠模型的可行性.方法 由美国Jackson实验室引进loxP标记的HIF-2α 基因小鼠,采用Cre/loxP重组酶系统和Alb-Cre转基因小鼠,通过多次繁殖杂交,建立肝脏特异性HIF-2α 基因敲除小鼠模型.利用PCR技术鉴别小鼠基因型,并用RT-qPCR检测小鼠肝脏、脂肪及肌肉组织HIF-2αmRNA水平,同时检测野生型小鼠和Alb-Cre+/HIF-2αfl/fl的纯合子小鼠血糖、血脂以及肝功能水平.3组HIF-2αmRNA数据比较采用单因素方差分析和Turkey检验.结果 PCR法成功检测出子代小鼠基因型,包括Alb-Cre+/HIF-2αfl/fl和Alb-Cre-/HIF-2αfl/fl纯合子小鼠.肝脏HIF-2α 基因敲除鼠肝脏组织HIF-2αmRNA表达量为0.10±0.02,明显低于野生型小鼠的1.00±0.10(HSD=-1.87,P<0.05).结论 采用Cre-LoxP技术可成功构建肝脏特异性HIF-2α 基因敲除小鼠.

摘要： 目的 拟构建DRD2基因大脑海马组织特异性敲除小鼠模型,旨在进一步深入研究DRD2的生物学功能.方法 运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-loxP重组酶系统,设计和构建打靶载体,然后将打靶载体电转至小鼠胚胎细胞,用PCR和Southern blot验证ES克隆的正确性,最后将筛选出的ES显微注射到胚囊内,经过PCR鉴定得到Neo delete杂合子小鼠(flox/+).将Neo delete杂合子小鼠(flox/+)自交获得Neo delete纯合子小鼠(flox/flox)小鼠,经PCR筛选出的在DRD2 flox/flox纯合子小鼠与海马组织特异性表达Cre基因的CaMKⅡα-Cre工具鼠杂交,获得了DRD2 flox/flox的特异性组织条件性敲除小鼠,并用定量PCR和Western blot法对其进行鉴定.利用PCR和Western blot方法检测成年DRD2条件性敲除小鼠大脑不同部位(前额、海马)的DRD2表达情况.结果 经过多层筛选、鉴定,最后得到DRD2 flox/flox的特异性组织条件性敲除小鼠.所制备的DRD2条件性敲除小鼠基因缺失主要发生在海马组织中,前额组织中表达水平变化不大.DRD2表达水平在不同小鼠的海马组织中降低.DRD2海马组织特异性敲除小鼠在交配饲养过程中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象,也未发现其他器官组织结构的异常改变.结论 成功建立大脑海马神经细胞特异性DRD2基因敲除模型,为进一步深入研究DRD2的生物学功能,尤其是DRD2在精神类疾病的发生、发展中的作用机制提供了研究基础.

摘要： 目的 构建单核细胞特异性KCNQ1基因条件性敲除小鼠模型。方法 将KCNQ1^flox/flox转基因小鼠与特异性表达cre酶的Lyz2-cre^+工具鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠基因型,并检测血尿酸(SUA)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等生化指标和血清白细胞介素1β(IL-1β)水平。结果 获得KCNQ1^flox/flox/Lyz2-cre^+小鼠,其各项生化指标与野生型小鼠比较差异无显著性(P>0.05),但血清IL-1β水平显著降低(t=3.622,P<0.05)。结论 成功构建单核细胞特异性KCNQ1基因条件性敲除小鼠模型;KCNQ1可能通过对单核细胞内IL-1β的调节作用参与痛风的炎症反应过程。

摘要： 本发明涉及转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用。具体地，发明人发现长度为1.8kb的Lcn5基因启动子序列能驱动外源基因在小鼠附睾头部（特别是中远端特定）区域表达，并由此构建了由该启动子驱动的外源Cre基因表达载体。这种转基因载体能驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异地表达，也可以驱动其他基因如CreERT2重组酶等的表达。应用这种转基因体系制备转基因小鼠，能获得很高的基因组整合率（>25%），并可准确、高效驱动外源基因在附睾头部中远端区域表达。本发明还建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。

摘要： 本发明公开Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法，涉及小鼠模型建立领域。主动脉夹层小鼠模型包括以下构建步骤：采用Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠，简称Best3

摘要： 本发明公开了一种GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及构建方法。具体地，通过利用Cre/loxP原理，在GLCCI1的一段目标序列两端各放置一个loxP序列，得到flox小鼠，将flox小鼠与全身性敲除Cre品系的小鼠交配繁殖，获得全身性敲除GLCCI1基因的小鼠品系，获得的GLCCI1基因敲除小鼠将可应用于GLCCI1基因及蛋白质功能研究。

摘要： 本发明公开了一种检测SR-BⅠ基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒，方法包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测。试剂盒包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、ddH

摘要： 本发明公开了一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒，方法包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测。试剂盒包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、RNase-free水以及引物和探针。设计的引物包括野生纯合型上游引物、野生纯合型下游引物、野生纯合型探针、敲除纯合型上游引物、敲除纯合型下游引物以及敲除纯合型探针。本发明的方法可在1h内完成基因型检测，而且成本较低，操作简单。本发明的方法结果准确、易判断，且还具有较高的灵敏度。

摘要： 本发明涉及转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用。具体地，发明人发现长度为1.8kb的Lcn5基因启动子序列能驱动外源基因在小鼠附睾头部（特别是中远端特定）区域表达，并由此构建了由该启动子驱动的外源Cre基因表达载体。这种转基因载体能驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异地表达，也可以驱动其他基因如CreERT2重组酶等的表达。应用这种转基因体系制备转基因小鼠，能获得很高的基因组整合率（>25%），并可准确、高效驱动外源基因在附睾头部中远端区域表达。本发明还建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。

摘要： 本发明公开了一种G3bp1条件性基因敲除小鼠模型，该模型由以下步骤构建：构建同源重组DNA载体；通过体外转录获得Cas9 mRNA和针对G3bp1基因2号内含子和3号内含子的gRNA；将同源重组DNA载体、Cas9 mRNA和gRNA注射到小鼠的受精卵中；培育获得条件性基因敲除小鼠。能够克服现有技术中G3bp1全身基因敲除小鼠胚胎致死，无法构建小鼠模型的困难，辅助G3BP1在心血管疾病中的研究。

摘要： 本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用，属于生命科学和生物技术领域。TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的sgRNA3和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的sgRNA14。本发明将合成的sgRNA和Cas9 mRNA以及打靶载体导入小鼠受精卵中，培育，筛选及交配，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型。

摘要： 本发明公开了SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，属于生物技术领域。构建方法包括：根据SLC35E1基因序列确定SLC35E1小鼠待敲除基因的两对特异性靶点gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，显微注射入小鼠受精卵并移植至代孕母鼠输卵管内，待产出小鼠后传代培养，经基因型鉴定得到稳定遗传的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型。通过构建的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型研究银屑病或分枝杆菌感染性疾病，并验证SLC35E1基因在制备和筛选治疗银屑病或分枝杆菌感染性疾病药物中的应用，为人分枝杆菌感染性疾病的作用机制和治疗提供依据。

摘要： 本发明公开了巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用，涉及生物技术领域。巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法为基于CRISPR/Cas9系统特异性敲除巨噬细胞TYMP基因，敲除位点为TYMP基因的第2外显子序列上游和第4外显子序列下游。通过该方法构建的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型能够存活五个月以上，在筛选抑制血小板活化相关药物和研究血栓和炎症相关疾病的分子机制方面具有很好的应用前景。