CRISPR/Cas9技术制备Hsf1基因敲除小鼠模型的应用研究

摘要

目的 探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因敲除的小鼠模型,为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础.方法 根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选,通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版,得到4个上游引物.随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选,筛选切割有效的sgRNA,从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验.运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板,接着体外转录Cas9mRNA.将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA 一起注射入健康的C57BL//6小鼠受精卵内,剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定.选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠,结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况.选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠,剪取鼠尾组织并测序,最终得到F2代纯合子敲基因小鼠.运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序,通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合,同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失.结果 经 PCR扩增得到上游引物 sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F 与下游引物sgRNAprimer-R.经过sgRNA的体外转录和筛选,sgRNA-1,sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高,被选取用于后续实验.将T7promoter添加到Cas9mRNA的5'端,运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA.把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养.把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部,并成功获得F0代小鼠.通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只.将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后,结合PCR与测序比对,共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只.将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交,得到F2代小鼠.通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察,证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列,电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带,鉴定为纯合子;得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育,结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型.结论 成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型,稳定性强,可重复性高,为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础.