利用CRISPR/Cas9构建Zfp217基因敲除细胞系和小鼠模型研究

摘要

脂肪生成过程中受到众多转录因子调控，过去二三十年大量研究证实，虽有大量转录因子被鉴定出来参与脂肪的发育调控，但机制仍不清晰。课题组前期在SV细胞诱导成脂分化过程中，利用RNA-seq和生物信息学分析，筛选出一个新的转录因子Zfp217可能参与调控脂肪生成。因此，本文以3T3-L1前脂肪细胞为研究材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系，探讨Zfp217对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响；此外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除小鼠，进一步验证Zfp217与脂肪形成的关系。
　　本研究主要内容包括：⑴筛选有剪切活性的sgRNA。首先利用sgRNAcas9_3.0.5软件和http://crispr.mit.edu/网站针对Zfp217基因第一外显子设计4个sgRNA，成功构建了CRISPR/Cas9系统（pX458）载体，利用T7E1酶切和DNA测序等方法初步鉴定出sgRNA-2、sgRNA-3及sgRNA-4有剪切活性。⑵构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系，研究Zfp217对3T3-L1细胞成脂分化的影响。将含有sgRNA-4的pX458载体转染3T3-L1细胞，获得了纯合敲除Zfp217单克隆细胞系。采用油红 O染色，观察 Zfp217基因敲除单克隆细胞系，发现纯合Zfp217基因敲除细胞系比对照组细胞的脂滴数量明显减少；Western Blot分析脂肪标志基因表达发现，敲除Zfp217明显抑制脂肪标志基因PPARγ和aP2蛋白表达。以上结果表明，敲除Zfp217能够抑制3T3-L1细胞的成脂分化。⑶制备Zfp217基因敲除小鼠。首先PCR扩增sgRNA-2和sgRNA-4体外转录模板，利用体外转录试剂盒将其进行体外转录及纯化，运用原核显微注射方式将sgRNA-2、sgRNA-4及Cas9 mRNA混合注射到小鼠受精卵并发育成囊胚，然后将其胚胎移植到假孕母鼠子宫内，21 d后共获得15只小鼠。⑷Zfp217基因敲除阳性小鼠的鉴定。F0代小鼠中，利用PCR基因分型和DNA测序方法获得10只阳性敲除的小鼠，结果表明Zfp217基因敲除小鼠构建成功。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1 前言

2 脂肪发育

3 锌指蛋白在脂肪生成中的作用

4 基因编辑的研究进展

5 基因功能的研究手段

6 研究目的与意义

第二章 材料与方法

1 试验材料

2 试验方法

第三章 结果与分析

1 靶向Zfp217基因sgRNA的设计

2 构建CRISPR/Cas9系统载体的构建

3 3T3-L1细胞荧光分选

4 sgRNA有效活性筛选

5 Zfp217基因敲除的单克隆细胞系鉴定

6 sgRNA-4脱靶效应的分析

7 油红O染色分析

8 Zfp217对成脂标志基因蛋白表达的影响

9 sgRNA的体外转录

10 Zfp217基因敲除阳性小鼠的获得

11 Zfp217基因敲除阳性小鼠测序鉴定

第四章 讨论

1 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9三代基因编辑技术比较

2 细胞水平上导入CRISPR/Cas9载体的方法

3 提高CRISPR/Cas9剪切效率与降低脱靶的方法

第五章 结语

1 本研究的主要成果与结论

2 创新性

3 研究的不足之处

参考文献

附录

致谢