CRISPR/Cas系统

摘要： CRISPR-Cas系统为细菌与古生菌的一种免疫防御机制。基于该系统的基因编辑技术在基因工程领域得到广泛应用,极大地加快了该领域研究的进步。本文从CRISPR-Cas系统介导的基因组编辑技术的发展趋势和最新应用及现状进行综述。

摘要： CRISPR-Cas系统是一种细菌的适应性免疫系统,参与特异性防御不同类型的可移动遗传元件,如质粒、噬菌体、转座子等的入侵。旨在分析肠球菌(Enterococcus)基因组中该系统的基因结构,并探讨其与细菌耐药基因之间的关系。NCBI数据库中下载10种肠球菌的全基因组信息,利用软件对CRISPR-Cas系统的分布、cas1基因、重复序列、间隔序列等进行比对分析;查找耐药相关基因,分析其与CRISPR-Cas系统之间的关系。235株肠球菌中含完整CRISPR-cas系统的有35株(14.9%),含确定CRISPR阵列196个和cas基因簇46个。肠球菌基因组中CRISPR系统主要为II-A型(80.4%),其次是II-C型(15.2%),cas1基因序列的系统发育分析结果与CRISPR-cas系统的分型基本一致。肠球菌CRISPR-Cas系统的分布在不同菌种之间差异较大;CRISPR-Cas系统可能阻碍肠球菌某些耐药基因的水平转移。

摘要： 衰老逐渐成为威胁人类健康的重要因素,其中基因突变及其累积是引发衰老的因素之一。基因编辑技术可以纠正或清除错误基因突变,从而具有延缓衰老和治疗衰老相关疾病的潜力。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)的基因编辑工具是基于细菌和古细菌获得性免疫系统发明的,已证明可修改多种生物体的基因组。通过对Cas蛋白的定点突变和表达优化改造,可提高CRISPR/Cas系统在靶向位点的编辑效率、保真性及降低其脱靶效应。随后,科学家们发明了许多基于Cas蛋白的编辑器,如碱基编器、引导编辑器、转座/重组酶等。CRISPR/Cas及其衍生的编辑器,可实现多种形式精确的基因修饰,从而满足不同的基因编辑需求。本文主要概述了CRISPR/Cas系统及其种类、Cas9(CRISPRassociated protein 9)蛋白及其变体、基于Cas9蛋白衍生的基因编辑器,并讨论了这些编辑器在衰老及其相关疾病,如早衰综合症、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性、神经退行性疾病等方面的应用研究进展。未来,高精确基因编辑器和递送技术的发明,将加速基因编辑技术用于治疗衰老相关疾病和逆转衰老的基础与临床研究,最终实现人类健康衰老。

摘要： CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。

摘要： 亿万年的时间里,噬菌体与细菌之间不断进行着攻击-防御-反击的战斗。细菌为保护自己免受噬菌体的入侵,进化出一系列复杂的防御系统。细菌防御系统的发现和对其分子机制的深入研究,推动了重要的生物学工具的发展,甚至整个生命科学领域革命性的进步。本文总结了细菌抗噬菌体感染的防御手段,并对其分子机制的研究进展做了简要综述。

摘要： 开发快速、灵敏、特异的检测方法对于新发突发人兽共患病、动物疫病的监测及防控至关重要。规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统以高敏感性、特异性及可扩展性的DNA和RNA识别为特点,已成为新一代的分子诊断工具,在病原体快速检测技术研发中得到广泛应用。在新型冠状病毒肺炎疫情中,基于CRISPR-Cas系统开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒(SHERLOCK和DETECTR)在美国相继获批,中国研发的基于CRISPR-Cas12系统的SARS-CoV-2检测试剂盒也已获批上市,这表明基于CRISPR-Cas系统的病原体检测方法在未来的应用前景非常可观。文章首先简述了CRISPR-Cas系统类型,尤其是常用于病原体检测的Cas9、Cas12和Cas13;介绍了CRISPR-Cas系统的作用机理以及广泛应用。同时分析了CRISPR-Cas检测平台研发的关键技术问题,包括靶标基因的序列保守性、靶标基因的富集与扩增、终信号不同的读取方式等,并对CRISPR-Cas系统的未来发展及应用前景进行了展望。

摘要： 盐碱胁迫是限制水稻生长发育和阻碍农业生产的重要因素,是世界范围内造成农作物产量损失的主要原因之一.CRISPR/Cas基因编辑系统是一种高效简单的基因编辑技术,在植物非生物胁迫响应研究方面具有重要的应用价值.本文主要介绍了CRISPR/Cas基因编辑系统的发展过程、分类以及水稻对盐碱胁迫的响应机制,论述了近年来CRISPR/Cas技术在水稻耐盐碱品种开发中的应用,并对其应用前景进行了展望.

摘要： 近年来,CRISPR-Cas系统病原核酸检测技术凭借其靶向精准、灵敏度高以及多重检测等特点,在即时检测(Point of Care testing,POCT)领域受到广泛关注。多种Cas蛋白具有顺式基因编辑功能和非特异性反式切割活性,基于这种特性成功实现了病原核酸检测,极大改善了POCT产品灵敏度低的问题。其中,以Cas12为靶点并反式切割单链DNA探针的系统既简单又高效。因此,就CRISPR-Cas12a的历史、分类、检测原理和在核酸检测中的应用进展、开发检测试剂的困难等方面做一综述。

摘要： 黑曲霉Aspergillus niger是有机酸与酶制剂的重要工业生产菌株,以极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势成为不可多得的细胞工厂.合成生物学与系统生物学的快速发展,不仅拉开了全面揭示黑曲霉细胞工厂高效运转机制的序幕,而且为高效黑曲霉细胞工厂的创建优化提供了新技术体系.作为新一代的基因组编辑技术,基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术为黑曲霉基因组定向改造与基因表达调控带来了革命性突破.本文重点综述该技术在黑曲霉中的最新进展及其在黑曲霉基因编辑与表达调控中的应用,并对其未来发展方向进行展望.

摘要： 近年来,规律间隔成簇短回文系统(CRISPR-Cas)作为基因编辑手段在动植物基因编辑中已广泛应用.现已被证实的Class2类CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas 12、CRISPR-Cas 14等均通过生物信息学手段被发掘出来,因此,生物信息学成为发现新CRISPR-Cas系统及其子类型的重要方法.笔者综述了Cas酶两类生物信息学发掘手段,一类方法是通过已知Cas酶建立隐马尔科夫模型(HMM)预测可能的同类Cas酶;另一类方法是以标志序列Cas1或CRISPR识别为基础分析上下游可能的Cas酶,同时讨论了两种方法的限制.在此基础上,综述了Cas蛋白和CRISPR序列进一步分析方法,包括Cas蛋白同源性、进化分析及CRISPR序列间隔序列(spacers)、前间隔序列(protospacers)前间隔序列临近基序(PAM)分析.

摘要： 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

摘要： 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术纠正猪KIT基因结构突变的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建分别靶向猪KIT基因内含子16和内含子17的打靶载体，转染猪肾细胞，使猪KIT基因实现拷贝删除，其中构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的任一项所示。本发明的方法简单易行，通过能够有效靶向，实现目标基因拷贝数的精确删除。

摘要： 本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组(GenBank ID:NC_001718.1)，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用Primer Premier 5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR‑DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA‑21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA‑21检测结果。本发明属于生物检测技术领域，可在短时间内实现对miRNA‑21的高灵敏、高特异性检测。

摘要： 隐性雄性不育在植物育种中具有重要利用价值，水稻中TDR基因功能缺失会引起彻底的隐性雄性不育，因而是基因工程创制隐性雄性不育的重要靶标。本发明公开了一种利用CRISPRCas9系统对水稻TDR基因进行定点突变的方法，通过本发明提供的定点突变方法可快速高效地创制TDR基因突变体从而获得隐性雄性不育材料；本发明进一步提供了一种对通过前述定点突变方法获得的特定TDR突变基因型进行检测的方法，可用于快速鉴定TDR定点突变当代转化子中靶位点是否存在突变，亦可用于后代特定突变基因型的基因分型鉴定。

摘要： 本发明公开了基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用。其包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。本发明的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其荧光强度较强，能够在活细胞条件下观察特定基因的各个时期的表达情况，可以获得特定基因在整个间期和分裂期的动态变化趋势，并且不会将细胞杀死。

摘要： 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA-C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

摘要： 本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法。本发明引入CRISPR‑Cas系统，通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a‑SDA和DNA‑AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。

摘要： 本发明公开了一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法。首先，靶标miRNA‑21作为模板，将两个核酸探针进行点击化学连接，其生成物可与磁珠(MBs)结合。然后用TdT对其连接的核酸探针和互补链miRNA‑21进行延伸。延伸出的poly‑T尾巴激活了CRISPR/Cas12a的反式切割能力，从而切割报告基因来产生荧光信号。microRNAs(miRNAs)检测的特异性和灵敏性在癌症的早期诊断和各种疾病的治疗中起着至关重要的作用。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas9高效快速连续基因编辑方法，首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9‑N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。