腺病毒介导miR-99a过表达抑制人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制

摘要

目的 探讨miR-99a过表达对人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制.方法 构建miR-99a的重组腺病毒Ad5-miR-99a,并感染人结肠癌HCT-8细胞.采用甲基化特异性PCR检测miR-99a、抑癌基因SOCS1和P16的甲基化水平;采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测miR-99a、DNAC5胞嘧啶甲基转移酶、SOCS1和P16的表达情况;采用MTT法、细胞集落形成和流式细胞术检测HCT-8细胞的体外增殖凋亡情况;采用裸鼠体内荷瘤实验检测HCT-8细胞体内成瘤性.结果 成功构建miR-99a腺病毒载体Ad5-miR-99a.Ad5-miR-99a感染HCT-8细胞后,Ad5-miR-99a组细胞中miR-99a表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05);Ad5-miR-99a组细胞中DNAC5胞嘧啶甲基转移酶表达显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05);Ad5-miR-99a组细胞中SOCS1和P16表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05).MTT法、细胞集落形成、流式细胞术和裸鼠体内荷瘤实验显示,Ad5-miR-99a组细胞的体外增殖和体内成瘤能力显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05).结论 miR-99a可显著抑制人结肠癌HCT-8细胞的体外增殖和体内成瘤能力,其机制可能与miR-99a过表达导致DNMTl表达升高,降低抑癌基因SOCS-1和P16甲基化程度,使得SOCS-1和P16高表达,从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用.