苹果汁中耐热菌的分离鉴定与PCR快速检测的研究

摘要

酸土脂环酸芽抱杆菌(A.acidoterrestris)，简称耐热菌，是重要的食品工业腐败菌。其显著特点是可以在温度20～70℃和pH2.0～6.0的高温低酸环境下生长。该菌芽孢的耐热能力分别为85℃时56min、90℃时15min、95℃时24min，因此巴氏灭菌不能除去此菌。在浓缩果汁中嗜酸耐热菌不繁殖代谢，但一旦稀释成低浓度的饮用果汁时，在常温下即代谢产生愈创木酚、卤酚，使果汁口感风味变差、浊度升高、形成沉淀导致产品品质下降。欧美各国要求每10克苹果浓缩汁中耐热菌的含量小于1个，耐热菌逐渐成为我国苹果浓缩汁行业产品出口所遭遇的主要的技术壁垒。我国对耐热菌研究属于起步阶段，主要集中在分离方法和控制上。果汁中芽孢杆菌菌种分布的研究和快速检测方面的研究也比较缺乏。 PCR技术是聚合酶链反应(Polymorase Chain Reaction，PCR)，80年代逐渐发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化突出优点。传统方法检测食源性微生物(有益细菌，腐败菌，病原细菌)的步骤繁琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程。并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。目前常用的耐热菌检测方法是常规的培养检测法，耗时很长，一般需要4-5日才能出检测报告。而应用PCR技术，只需数小时就可以检测出目的菌。 试验选择了耐热菌的16SrDNA的高变区V2区和V4区某一段作为特异性引物的接合区域，以实现对此种微生物的特异的快速检测。通过试验研究得到以下结论： 1.从本研究结果看出：在苹果汁中生长的酸土环脂酸芽抱杆菌不是单一的菌，而是形态不同，生理生化性质不同，营养利用状况不同的菌群。除此之外，还有别的脂环酸芽孢杆菌菌种存在。 2.通过优化试验，最优PCR反应体系为：模板DNA 5μL，10xbuffer KCl 2.5μL，浓度为25mmol/μl的Mg2+2.5μL，浓度为2.5mmol/μL的dNTPS 2μL，浓度为10μg/L的正反引物各0.5μL，浓度为5U/μL，的Taq DNA聚合酶0.25μL，总体积25μL。反应条件为：94℃预变性4min后进入PCR循环，循环程序是94℃变性30S，58℃30S，72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸5min。 3.得出耐热菌DNA最佳提取方法：比较了CATB法、氯化苄法、水浴煮沸法和微波炉提取法，发现微波炉提取法是最佳DNA模板提取法，其优点是效率高，单管操作，简便快捷，费时最少。 4.优化后的扩增体系下，PCR检测耐热菌低限是3.2x102cfu/mL。 5.优化后的PCR扩增体系检测灵敏度不受苹果汁的干扰，在实际的生产检测中，当果汁里含有芽孢浓度为1cfu/10mL～2 cfu/10mL时，在45℃，260r/min的培养条件下，10h后目的菌可被检测出来。

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论文说明：缩略词

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第一章文献综述

1.1我国苹果汁行业的现状和存在的问题及解决办法

1.1.1我国苹果汁行业的现状分析

1.1.2我国苹果汁行业存在的问题

1.1.3目前世界果汁加工过程存在的4大技术难题

1.1.4微生物对苹果汁品质的影响

1.1.5苹果汁行业发展前景

1.1.6对我国苹果汁行业存在问题的解决措施

1.2国外脂环酸芽孢杆菌研究进展

1.2.1脂环酸芽孢杆菌研究概况

1.2.2脂环酸芽孢杆菌的性质研究

1.2.3脂环酸芽孢杆菌的分离和鉴定方面的研究

1.3国内对苹果汁中耐热菌的研究概况

1.3.1脂环酸芽孢杆菌分离

1.3.2脂环酸芽孢杆菌快速检测

1.3.3耐热菌控制方面

1.4 PCR快速检测

1.4.1 PCR快速检测研究概况

1.4.2 PCR快速检测过程

1.4.3 PCR快速检测食品微生物中出现的假阳性假阴性问题

1.4.4 PCR快速检测在定量方面的研究

1.5本研究的目的与意义

1.6研究内容

第二章苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的分离与鉴定

2.1材料

2.2药品

2.3主要试验仪器

2.4试验方法

2.4.1主要培养基配制

2.4.2试验方法与步骤

2.5试验结果与分析

2.5.1分离与筛选结果

2.5.2标准菌标准菌标准曲线和pH变化

2.5.3标准菌株和待测菌的显微观察结果

2.5.4各菌种的菌落形态

2.5.5各菌种的生理生化特征

2.5.6各菌种间关系的聚类

2.6小结

第三章苹果汁中耐热菌的PCR快速检测

3.1试验材料

3.2试验仪器

3.3试验方法

3.3.1溶液配制

3.3.2耐热菌PCR反应体系

3.3.3 PCR反应条件设定为：

3.3.4引物

3.3.5琼脂糖凝胶电泳

3.3.6 DNA模板提取

3.3.7优化体系的检测体系检测最低限试验

3.3.8苹果汁中耐热菌PCR敏感度检测

3.3.9在苹果汁中培养时间与PCR检测的关系

3.4试验结果

3.4.1模板DNA提取方法的比较

3.4.2 PCR条件优化

3.4.3特异性检验

3.4.4优化体系的检测体系检测最低限试验

3.4.5苹果汁中耐热菌PCR敏感度检测

3.4.6在苹果汁中耐热菌培养时间与PCR检测的关系

3.5小结

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

参考文献

致 谢

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