生物转化法制备富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料的方法

摘要

本发明提供了一种富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料及其制备方法，本发明的方法包括步骤：亚油酸与占亚油酸重量1％～2％的亲油硬脂酸单甘油酯混合，制成亚油酸乳化液；将亚油酸乳浊液加入到原料奶中，添加量为1％～5％，然后均质，杀菌，之后冷却到42±2℃，加入包含植物乳杆菌的发酵菌种，42±2℃发酵6～10h，待pH达到4.0±0.1左右时终止发酵，得到酸奶基料；上述酸奶基料经稀释制得富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。本发明通过对工艺条件的合理控制，使所制备得到的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料具有独特的风味和清爽的口感以及良好的稳定性。

说明书

技术领域

本发明是关于一种活性乳酸菌饮料及其制备方法，具体是关于一种利用生物转化法制备富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料的方法，以及所制备得到的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料，属于发酵乳制品加工领域。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是含有共扼双键的一系列十八碳二烯酸(Octadecadienoic acid)的混合物，是由必需脂肪酸亚油酸(Linoleic Acid，LA)衍生的共轭不饱和双键位于不同位置的十八碳二烯酸几何异构体的总称。共轭亚油酸能清除人体内的自由基，增强人体的抗氧化能力和免疫能力，调节血液胆固醇和甘油三酸脂水平，促进生长发育，促进脂肪氧化分解，防止动脉粥样硬化，促进人体蛋白合成，对人体进行全面的良性调节；共轭亚油酸还可清除血管中的垃圾，有效调节血液黏稠度；并能显著增加人体的心肌肌红蛋白、骨骼肌肌红蛋白含量，提高人体细胞的血液摄取和贮存氧气的能力；能增强细胞膜的流动性，维持细胞的正常结构及功能。

目前共轭亚油酸主要来源于反刍动物，研究证明，人体摄取3g/d的共轭亚油酸对于预防癌症有积极作用。乳制品(脂肪含量0.55～9.12mg/g)是人类获得共轭亚油酸的主要来源物质，然而，即使在以乳制品及动物制品作为主食的西方国家，共轭亚油酸的人均摄入量也远少于最佳摄入量，因此，向乳制品中强化共轭亚油酸是有必要的。但是直接添加共轭亚油酸成本较高，并且会造成分散不均匀。

通过化学合成或生物转化法可以大量制备共轭亚油酸。但化学合成的共轭亚油酸异构体组成复杂，无法获得单一的异构体，对人类健康是否具有负面影响还未知。利用生物合成法合成共轭亚油酸，无毒、无害、无副作用，并且有利于产品的开发应用。

植物乳杆菌(Lactobacillu plantrum)广泛存在于传统发酵制品中，尤其在以植物为原料的发酵制品中较为常见，同时植物乳杆菌作为人体肠道内的主要的益生菌，对维持人体肠道环境平衡、抑制致病菌生长发挥着重要的作用。目前有研究发现，植物乳杆菌在发酵介质中具有将亚油酸转化为共轭亚油酸的能力，最大转化率可达到30％。因此，利用植物乳杆菌转化亚油酸生成共轭亚油酸能有效降低成本，并且对人体无毒、无害、无副作用。

CN101731335A提供了一种通过生物转化法生产富含共轭亚油酸酸奶的方法。但是并没有关于植物乳杆菌的生物转化作用生产富含共轭亚油酸的活性乳饮料的相关研究。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用生物转化法制备富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料的方法，通过对工艺条件的合理控制，使所制备得到的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料具有独特的风味和清爽的口感以及良好的稳定性。

本发明的另一目的在于提供一种富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料，其中所含有的共轭亚油酸由底物中的亚油酸通过生物转化法来实现的。

乳酸菌饮料是以牛(羊)乳或复原乳为原料经乳酸菌培养发酵制得的乳液，并且加入水、糖液等调制而成的饮料制品。现有的乳酸菌饮料由于其碳水化合物、蛋白质、游离氨基酸更易于人体消化吸收，而且其口感更清爽，更适合人们日常饮用。根据是否进行灭菌可以将乳酸饮料分为活性乳酸菌饮料和非活性乳酸菌饮料；活性乳酸菌饮料所含的益生菌耐酸性和生长活性很强，具有很好的肠胃保健功能。

本发明提供了一种富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料的制备方法，该方法包括步骤：

(1)制备亚油酸乳浊液：

亚油酸与占亚油酸重量1％～2％的亲油硬脂酸甘油酯混合，制成亚油酸乳化液；

(2)制备酸奶基料：

将亚油酸乳浊液加入到原料奶中，添加量为1％～5％(以酸奶基料的总重量为基准)，然后在55～65℃、15～30MPa下进行均质，再于90～120℃杀菌5min～120min，之后冷却到42±2℃，加入包含植物乳杆菌的发酵菌种，42±2℃发酵6～10h，待pH达到4.0±0.1时终止发酵，得到酸奶基料；

(3)上述酸奶基料经稀释制得富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。

除特别说明外，本发明中所述比例和含量均为重量比例和含量。

本发明通过植物乳杆菌发酵的方法，将发酵乳中游离的亚油酸底物转化为共轭亚油酸，并将利用此发酵乳制作活性乳饮料，提高了活性乳饮料中的共轭亚油酸水平，还能进一步扩大乳饮料的功能性，按照本发明的方法制得的活性乳酸菌饮料，富含共轭亚油酸，且由于此饮料所含有的共轭亚油酸是植物乳杆菌利用游离的亚油酸进行转化而来的，无任何外来添加物质，对人体安全、无副作用。

本发明人经过研究发现，由于亚油酸的脂溶性的特征，若将其直接添加到发酵基质中会造成分散的不均匀。发明人经过反复试验，最终确定通过配制亚油酸乳浊液的方法来解决此问题。具体是将亚将亚油酸与占亚油酸重量1％～2％的亲油硬脂酸单甘油酯混合，将混合物通过超声乳化1min～3min，超声条件优选为：180～220W，2～5s开，2～5s停，即可形成稳定的亚油酸乳浊液。这样处理能使亚油酸在发酵基质中分散均匀，增加亚油酸与菌株细胞的接触面积，从而提高亚油酸的转化率。

发明人对采用两种处理方法对发酵酸奶中的亚油酸转化为共轭亚油酸的转化率的影响进行了比较，两种处理分别为直接向底物中添加亚油酸以及添加本发明中配制的亚油酸乳浊液，其他工艺条件相同，具体对比结果见表1。

表1不同处理底物中的亚油酸生成共轭亚油酸的转化率

通过表1可知，在本发明的添加范围内，将亚油酸配制成乳浊液时，亚油酸的转化率明显高于直接向底物中添加亚油酸时的转化率。

由于本发明的共轭亚油酸是通过植物乳杆菌转化发酵基质中的亚油酸所得，因此，亚油酸的添加量对发酵的影响作用较大。研究发现，较低浓度的脂肪酸对微生物的生长有促进作用，而当脂肪酸浓度达到一定程度时，则会对微生物的生长产生抑制作用。相对于革兰氏阴性菌株而言，革兰氏阳性菌的生长更容易被脂肪酸影响。其中顺式脂肪酸对菌体生长的影响高于反式脂肪酸。由于顺式脂肪酸会吸附在细胞膜上而干扰细菌细胞膜的渗透性，因此较高浓度的亚油酸对革兰氏阳性菌的生长具有抑制作用。

根据本发明的优选具体实施方案，本发明中，控制所得富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料中共轭亚油酸的含量为0.005％～0.2％，更优选0.01％～0.1％。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述发酵菌种为包含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌按照的混合菌种，所述嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌的添加比例为2∶1∶1～5，例如可以是2∶1∶1、2∶1∶2、2∶1∶3、2∶1∶4、2∶1∶5，最优选添加比例为2∶1∶2。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述发酵菌种还可包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、干酪乳杆菌(L.casei)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus.GG)等益生菌中的一种或多种。这些菌种的具体添加量可以参照所属领域的常规操作进行。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述酸奶基料经稀释后制得的活性乳酸菌饮料中，所述酸奶基料的含量为20％～50％，优选为20％～40％，且该活性乳酸菌饮料的甜度为折合成其中含有9％～15％的蔗糖的甜度，产品pH3.5～4.0。

根据本发明的具体实施方案，所述甜度可以用甜味料调节，所述甜味料可以选自蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖醇、安赛蜜、阿斯巴甜和甜蜜素中的一种或多种。所述产品pH值可以用酸味调节剂调节，例如可以是苹果酸、柠檬酸、乳酸等。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，在所述酸奶基料稀释制备活性乳酸菌饮料的过程中，还加入了0.1％～0.8％的稳定剂，所述稳定剂选自CMC、大豆多糖体、果胶、PGA、结冷胶、黄原胶、海藻酸钠中的一种或多种。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，是将甜味料、稳定剂与水混合均匀，杀菌并降温后与酸奶基料混合，混合后的物料在20～30℃、15～30MP压力下均质后灌装，得富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料产品。

本发明所述的乳酸菌饮料可以分为酸乳型以及果蔬型，酸乳型乳酸菌饮料是在酸奶的基础上将其破碎，配入白糖、香料、稳定剂等通过均质而制成的均一稳定的液态饮料；果蔬型乳酸饮料是在发酵乳中加入适量的浓缩果汁(如橙、桃、蓝莓、葡萄等)或在原料中配入适量的蔬菜汁浆(如胡萝卜、番茄、芹菜等)共同发酵后，在通过加糖、加稳定剂或香料等调配、均质后制作而成。

根据本发明的优选具体实施方案，本发明的乳酸菌饮料的配料组成中包括：20％～50％(优选30％～40％)的酸奶基料、0.2％～0.6％的果胶(或CMC 0.3％～0.6％)、9％～15％的白砂糖或同等甜度的其他甜味料、0.02％～0.06％的柠檬酸或乳酸，以及适量的纯水。

本发明还提供了按照本发明的方法制备得到的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。该富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料中，活菌数≥1.0×10⁷cfu/ml，蛋白含量≥1.0％。具有独特的风味和清爽的口感以及良好的稳定性。

综上所述，本发明通过在在酸奶发酵过程中添加植物乳杆菌，将发酵基质中的亚油酸通过生物转化法转化为共轭亚油酸，并以此酸奶为基质，制作活性乳酸菌饮料，提高了活性乳饮料中的共轭亚油酸水平，还进一步扩大了乳饮料的功能性。本发明通过恰当的工艺手段，使得到的饮料不仅具有益生菌的保健功能，还具有独特的风味和清爽的口感，以及良好的稳定性。本发明的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料，具有重要的生理功能，是符合现代人需要的功能性活性乳酸菌饮料制品，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。

实施例1富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料的及其制作方法

1、制备亚油酸乳浊液：

向亚油酸中加入占其重量2％的亲油硬脂酸单甘油酯，通过超声乳化1min(200W，3s开，3s停)，制成亚油酸乳化液(乳浊液)。

2、制备酸奶基料：

(1)原料奶的标准化：选择优质、安全、合格的鲜牛奶为主要原料进行标准化；

(2)配料：将亚油酸乳浊液加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的3％；

(3)均质：将原料奶升温至60℃进行至均质，均质压力为20MPa；

(4)杀菌：将上述均质后的料液进行杀菌，杀菌要求为95℃，10min；

(5)冷却：将杀完菌的料液急冷至42±2℃；

(6)接种、发酵：将混合菌种(混合菌种包括：嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌＝2∶1∶2，初始接种量为1×10⁷cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均匀，在42±2℃的条件下，保温发酵6～10h，待pH达到4.0左右时终止发酵，得到酸奶基料。

3、活性乳酸菌饮料的制备：

活性乳酸菌饮料配方：酸奶基料30％，白砂糖12％，果胶0.3％，柠檬酸0.04％，余量纯水；

1)糖液的制备：在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至65℃，将配方果胶及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121℃杀菌10min，后冷却至20℃；

2)加入奶基：将步骤2中发酵好的酸奶基料按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；

3)调酸：调控物料温度至25℃，加入柠檬酸进行调酸，调至pH3.6，达到酸甜比可口；

4)均质：将上述饮料进行均质，均质压力为20MPa，要求均质机提前杀菌，且均质温度要低于50℃，优选20～30℃，防止菌株活力的降低；

均质后灌装，得到本实施例的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。

实施例2富含共轭亚油酸的活性褐色乳酸菌饮料的及其制作方法

1、制备亚油酸乳浊液：

向亚油酸中加入占亚油酸重量1％的亲油硬脂酸甘油酯，通过超声乳化2min(220W，2s开，2s停)，制成亚油酸乳化液(乳浊液)。

2、制备酸奶基料：

(1)原料奶的标准化：选择优质、安全、合格的鲜牛奶为主要原料进行标准化；

(2)配料：将亚油酸乳浊液加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的3％，在原料奶中加入酸奶基料总重量15％的果葡糖浆；

(3)均质：将原料奶升温至65℃进行至均质，均质压力为20MPa；

(4)褐变：将上述均质后的料液进行杀菌，杀菌要求为121℃，10min；

(5)冷却：将杀完菌的料液急冷至42±2℃；

(6)接种、发酵：将混合菌种(嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌＝2∶1∶3，初始接种量为1×10⁷cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均匀，在42±2℃的条件下，保温发酵6～10h，待pH达到4.0左右时终止发酵，得到酸奶基料。

3、活性乳酸菌饮料的制备：

活性乳酸菌饮料配方：酸奶基料30％，白砂糖9％，CMC 0.4％，柠檬酸0.03％，余量纯水；

1)糖液的制备：在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至60～65℃。将配方稳定剂及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121℃杀菌10min，后冷却至10～20℃；

2)加入奶基：将步骤2中发酵好的奶基按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；

3)调酸：调控物料温度至25℃，加入柠檬酸进行调酸，调至pH3.5，达到酸甜比可口；

4)均质：将上述饮料进行均质，均质压力为20MPa，要求均质机提前杀菌，均质温度30℃，防止菌株活力的降低；

均质后灌装，得到本实施例的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。

实施例3富含共轭亚油酸的低脂活性乳酸菌饮料的及其制作方法

1、制备亚油酸乳浊液：

向亚油酸中加入占亚油酸重量2％的亲油硬脂酸单甘油酯，通过超声乳化3min(180W，5s开，5s停)，制成亚油酸乳化液(乳浊液)。

2、制备酸奶基料：

(1)原料奶的标准化：选择优质、安全、合格的脱脂鲜牛奶(要求脂肪含量＜1％)为主要原料进行标准化；

(2)配料：将亚油酸乳浊液加入到原料奶中，添加量为酸奶基料总重量的3％；

(3)均质：将原料奶升温至60℃进行至均质，均质压力为20MPa；

(4)杀菌：将上述均质后的料液进行杀菌，杀菌要求为95℃，10min；

(5)冷却：将杀完菌的料液急冷42±2℃；

(6)接种、发酵：将混合菌种(嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌＝2∶1∶4，初始接种量为1×10⁷cfu/mL)接种至上述冷却好的料液中搅拌均匀，在42±2℃的条件下，保温发酵6～10h，待pH达到4.0左右时终止发酵。

3、活性乳酸菌饮料的制备：

活性乳酸菌饮料配方：酸奶基料35％，白砂糖13％，果胶0.25％，乳酸适量，余量纯水；

1)糖液的制备：在配料罐中加入配方中规定的纯水，升温至60～65℃。将配方稳定剂及白砂糖进行干混合后溶于纯水中，循环20min后，121℃杀菌10min，后冷却至20℃；

2)加入奶基：将步骤2中发酵好的酸奶基料按照配方要求加入配料罐，充分搅拌均匀，此操作注意在无菌状态下完成；

3)调酸：调控物料温度至25℃，加入乳酸进行调酸，调至pH3.5，达到酸甜比可口；

4)均质：将上述饮料进行均质，均质压力为25MPa，要求均质机提前杀菌，均质温度25℃，防止菌株活力的降低；

均质后灌装，得到本实施例的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料。

对比例1

本对比例中，未添加亚油酸，而是直接以原料奶发酵制备酸奶基料并进一步制备活性乳酸菌饮料，其他工艺条件同实施例1，制备得到作为对比样的乳酸菌饮料。

贮藏期内活性乳酸菌饮料中共轭亚油酸含量以及活菌数的检测

紫外分光光度法依据共轭亚油酸在232～234nm的紫外区有最大特异性吸收峰，因此研究中可在这个波长范围内检测共轭亚油酸的存在及含量，此方法适用于产品中共轭亚油酸总含量的测定。而且紫外检测法仪器价格便宜、检测成本低、操作简便快速，适用于大批量样品的快速检测。

具体方法为以CLA浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制CLA紫外吸收标准曲线，通过检测吸光值即可得到产品中的共轭亚油酸含量。

本发明中对实施例1～3以及对比例1得到的产品贮藏期内的共轭亚油酸含量进行检测，并且检测贮藏期内活菌数的变化，得到的结果如下表，其中表2为贮藏期内活菌数的变化表，初始接种量均为1×10⁷cfu/mL，表3为贮藏期内产品共轭亚油酸的含量。

表2乳酸菌饮料贮藏期内活菌数的变化(单位：log cfu/g)

  刚下线饮料产品  贮藏1d  贮藏7d  贮藏14d  贮藏21d 实施例1  8.82±0.02  8.79±0.03  8.48±0.01  8.56±0.01  8.48±0.02 实施例2  8.79±0.01  8.68±0.01  8.39±0.03  8.43±0.03  8.36±0.01 实施例3  8.90±0.03  8.80±0.02  8.53±0.03  8.62±0.02  8.50±0.03 对比例1  8.85±0.01  8.76±0.03  8.45±0.02  8.51±0.01  8.39±0.01

表3乳酸菌饮料在贮藏期内共轭亚油酸含量的变化(单位：mg/g)

  刚下线饮料产品  贮藏1d  贮藏7d  贮藏14d  贮藏21d 实施例1  0.42  0.39  0.35  0.31  0.28 实施例2  0.41  0.37  0.33  0.30  0.27 实施例3  0.50  0.48  0.42  0.37  0.33 对比例1  0.0110  0.0080  0.0040  0.0032  0.0027

根据表2、表3可知，在贮藏期内，随着菌株的逐渐死亡，饮料内的共轭亚油酸含量也随之降低，说明菌株对共轭亚油酸的生物转化与菌株的生长密切相关。因为在对数期内，菌株即大量繁殖，数量呈对数级数快速增加，此时共轭亚油酸开始快速积累。该阶段共轭亚油酸的积累量占到生成总量的百分之五十以上。而未添加亚油酸底物的乳饮料中虽然也能检测到生成共轭亚油酸，但是含量远远低于本发明的实施例。

富含共轭亚油酸的活性乳饮料的口感和风味品评验证

对本发明实施例1至实施例3及对比例1生产得到的产品进行口感和风味的盲测实验(对比样为未添加亚油酸底物发酵的活性乳酸菌饮料)。主要感官检查项目：组织状态、色泽、口感、酸甜度、风味等。参加实验人数共30人。感官和风味评分标准如表4：

表4富含CLA的活性乳饮料的口感和风味评分标准

评价结果记录于表5：

表5感官评价结果

  评分项目  实施例1  实施例2  实施例3  对比例1  色泽  0.95  0.98  0.92  0.94  组织状态  0.93  0.91  0.96  0.93  口感  0.98  0.97  0.94  0.89  风味  0.91  0.93  0.94  0.86  酸甜度  0.92  0.94  0.95  0.92  总分  4.69  4.73  4.71  4.54

通过此感官评价表可知，本发明的经过生物转化法得到的含有共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料与对比样相比，口感和风味分值较高。说明此种通过生物转化法制备的富含共轭亚油酸的活性乳酸菌饮料深受欢迎，有广阔的应用前景。

富含共轭亚油酸的活性乳饮料在贮藏期内的稳定性

为了检测添加亚油酸底物以及生物转化生成的共轭亚油酸对乳酸菌饮料的稳定性是否有影响，发明人对实施例1～3及对比例1得到的产品贮藏期内的产品的稳定性进行了观察，结果见表6：

表6产品在贮藏期内的稳定性

  发酵结束  贮藏1d  贮藏7d  贮藏14d  贮藏21d 实施例1  状态正常  状态正常  状态正常  略有乳清析出  略有乳清析出 实施例2  状态正常  状态正常  状态正常  略有乳清析出  略有乳清析出 实施例3  状态正常  状态正常  状态正常  略有乳清析出  略有乳清析出

 对比例1  状态正常  状态正常  状态正常  略有乳清析出  略有乳清析出

根据表6可知，本发明在发酵时添加亚油酸底物时，与未添加的对比样相比，对饮料的稳定性没有影响，所得到的产品在贮藏期内具有较好的稳定性，适合商业生产。