植物乳杆菌ZS2058生物转化法制备共轭亚油酸的研究

摘要

共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是亚油酸(Linoleic Acid，LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能，如抗癌、抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中c9，t11-18：2被认为最具生物活性。乳酸菌生物转化共轭亚油酸是当前生物法转化共轭亚油酸研究的热点，为共轭亚油酸的合成提供了另一种有效的途径。 本文主要通过比较不同反应体系中植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的转化率，确定最适合的反应体系为静息态细胞在磷酸盐缓冲溶液中生物转化CLA。通过正交实验确定了最适合的反应条件为：底物浓度为3mg/mL，细胞浓度为4×10<'10>cfu/mL，反应温度：37℃，pH6.0，转化时间24h。在此反应条件下，CLA转化率为31.76％。通过GC法和GC-MS法检测，发现反应过程中主要产生两个产物：CLA和羟基脂肪酸HY。产物CLA中c9，t11-CLA占96.60％，t10，c12-CLA占2.40％，还有少量其他异构体，说明亚油酸异构酶有高度的专一性。 根据植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的反应进程曲线以及转化机理探索实验可知，c9，t11-CLA是生物转化过程的反应中间体，其可能的反应机理是：第一步，LA在亚油酸异构酶的作用下异构化为CLA：第二步，c9，t11-CLA在水合酶的作用下进一步转化为羟基脂肪酸HY。 本文采用超声波破碎细胞获取亚油酸异构酶粗酶，最佳的破碎条件为：破碎功率320W，破碎工作时间为7.5min，菌悬液浓度11.25g/50mL，提取pH7.0，添加0.2mol/LNaCl溶液。并研究了亚油酸异构酶酶反应的最适条件为：pH7.5，温度37℃，LA浓度0.8mg/mL，酶液体积3mL以磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液为反应介质，Ca<'2+>，螯合剂1，10-菲哕啉和EGTA对LI粗酶没有明显的影响。酶液在4℃，pH7.5的磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液中有较好的稳定性，酶液中添加20％甘油和0.2mol/LNaCl溶液有助于提高亚油酸异构酶的稳定性。 对亚油酸异构酶的分布进行了研究，通过改变离心速度，对收集到的不同部位进行酶活检测发现，酶活在菌体碎片，可溶蛋白和细胞膜中的分布比例分别为：26.53％，30.80％和42.67％。同时，粗酶液经过0.7％TritonX-100提取5h后，酶活能够提高3.47倍。由此可以知道亚油酸异构酶是一种膜结合酶，并且在菌体培养过程中添加LA能诱导其产生。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1共轭亚油酸(CLA)概况及其生理功能

1.1.1共轭亚油酸

1.1.2 CLA的主要生理功能

1.1.3 CLA的主要检测方法

1.2生物转化法制备CLA

1.2.1生物酶异构化法的菌种

1.2.2生物转化CLA的机理探索

1.2.3生物转化CLA的国内外研究状况

1.3立题意义

1.4主要研究内容

第二章植物乳杆菌ZS2058生物催化共轭亚油酸反应机理的初步研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果和讨论

2.3.1微生物细胞生物合成CLA的反应结果

2.3.2不同生物转化反应体系对CLA转化的影响

2.3.3植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA反应途径的初步确定

2.4本章小结

第三章植物乳杆菌ZS2058全细胞在缓冲液中生物转化CLA反应条件的研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1脲包法制备LA

3.3.2诱导培养对ZS2058转化CLA的影响

3.3.3氧气和抗氧化剂对ZS2058转化CLA的影响

3.3.4反应体系中细胞浓度对ZS2058转化CLA的影响

3.3.5反应体系中底物浓度对ZS2058转化CLA的影响

3.3.6反应pH值对转化的影响

3.3.7反应温度对转化的影响

3.3.8正交实验

3.4本章小结

第四章亚油酸异构酶的提取及其粗酶酶活特性的研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1超声波破碎对亚油酸异构酶粗酶液提取的影响因素分析

4.3.2 TritonX-100对亚油酸异构酶粗酶提取的影响

4.3.3亚油酸异构酶的分布

4.3.4亚油酸异构酶粗酶液酶学特性研究

4.4本章小结

主要结论

展望

致谢

参考文献

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