野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶慢病毒表达载体的构建及其验证

摘要

目的为构建野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶(HPA)的慢病毒表达载体,以探讨HPA的酶活性作用和非酶活性作用。方法根据GV358慢病毒质粒载体序列和HPA基因序列设计用于无缝克隆的引物,HPA的PCR扩增产物与线性化的GV358质粒载体连接,获得重组慢病毒质粒。将经测序验证的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒感染液并感染HEL细胞,利用Western印迹法鉴定HPA过表达效果;利用流式细胞术检测细胞表面硫酸乙酰肝素(HS)的表达量;利用ELISA检测多配体蛋白聚糖1(syndecan-1)的释放量,以验证野生型和酶活缺失型HPA慢病毒表达载体的生物学效应。结果重组慢病毒质粒测序结果符合预期;Western印迹法检测结果表明,过表达HPA的HEL细胞有明显的HPA蛋白表达;流式细胞术结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞表面HS表达量的几何平均荧光强度(160.0±8.0)明显低于空载体对照细胞(345.0±15.2)(P<0.01);ELISA结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞培养基中多配体蛋白聚糖1的释放量(59.0±3.8)ng·L-1较空载体对照细胞(32.2±3.9)ng·L-1明显增多(P<0.01);而过表达酶活缺失型HPA的HEL细胞系细胞表面HS的表达量(353.0±14.0)和培养上清中多配体蛋白聚糖1的释放量(30.9±2.9)ng·L-1则与空载体对照细胞相当。结论成功构建了野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒表达载体,并利用HEL细胞系对野生型和酶活缺失型HPA的生物学效应进行了验证,为研究HPA在机体病理生理过程中的作用机制提供了新的工具。