野生型及缺失型pFLAG--Dpr1载体的构建和PAH蛋白诱导表达、纯化及红细胞血影包埋的研究

摘要

Dapper1(Dpr1)蛋白是Dapper蛋白家族成员之一，为经典Wnt信号通路的调控分子，在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。Dpr1蛋白由定位于14q23.1的DACT1基因编码，836个氨基酸组成。研究发现，在正常组织中，Dpr1 mRNA主要在胎儿脑、眼、羊膜、心脏和成人坐骨神经以及白细胞等组织中表达;在不同肿瘤组织中，Dpr1 mRNA主要在胃癌、结肠癌、生殖系统肿瘤、急性成淋巴细胞瘤、软骨肉瘤和副甲状腺瘤中表达。 Dpr1蛋白在早期动物胚胎发育的多个过程中起重要作用，主要通过对经典Wnt信号通路的负向调控来完成。且Dpr1可受其他蛋白的调节，使Wnt通路成为网络调节系统的中心。在这过程中，Dpr1蛋白通过C端的PDZ-Binding结构域与Dishevelled(Dsh)蛋白的DEP结构域(dishevelled，Egl-10 and pleckstrindomain)结合后，使得Dsh蛋白被降解，胞内游离的β-catenin蛋白磷酸化而降解，无法转移至核内与T细胞转录因子结合，从而抑制经典Wrnt信号通路。 本课题组前期研究发现，Dpr1蛋白是周期素G2(Cyclin G2)的结合蛋白，并可能由此介导Cyclin G2对经典的Wnt信号通路的调节。本研究构建野生型及缺失型pFLAG-Dpr1重组表达载体，旨在确定Dpr1蛋白结合Cyclin G2的氨基酸区域，为进一步研究Cyclin G2与Dpr1蛋白的相互作用机制奠定了基础。 材料方法 一、引物设计与合成 依据Dpr1蛋白结构域的分布特点，利用人ACT1基因的cDNA序列设计一对野生型及四对缺失型Dpr1引物，利用缺失型Dpr1引物经过PCR反应可以分别获得缺失Dpr1的第312-836、620-836、1-304、1-610位氨基酸的编码基因片段。 二、PCR扩增 以前期构建的pCMV-Tag5A-Dpr1质粒为模板，分别进行PCR反应，扩增出包含各自对应的DACT1基因编码区的片段。 三、野生型及缺失型pFLAG-Dpr1载体的构建及鉴定 分别将PCR扩增产物和pFLAG-CMV-2质粒以XbaⅠ/ HindⅢ双酶切，回收纯化目的片段和载体，连接过夜后转化，进行菌落PCR扩增，以鉴定克隆菌落中是否含有目的基因。扩大培养候选阳性克隆，提取质粒后进行酶切验证，进一步鉴定质粒中是否插入目的基因。 四、DNA测序分析 采用CMV-30和CMV-24通用引物，对野生型及四种缺失型pFLAG-Dpr1重组表达载体进行DNA测序分析。 五、野生型及缺失型Dp订表达检测 将编码序列正确、开放阅读框架完整的野生型与四种缺失型pFLAG-Dpr1载体分别转染HEK-293细胞，培养48 h后提取总RNA与总蛋白，RT-PCR及WesternBlot检测野生型与缺失型Dpr1表达情况。 实验结果 一、PCR扩增结果 以pCMV-Tag5A-Dpr1质粒为模板，应用野生型及四种缺失型引物分别扩增出与预计长度相符的目的片段。 二、野生型及缺失型pFLAG-Dpr1载体构建鉴定结果 菌落PCR结果表明，部分克隆菌落中含有目的基因。对部分阳性菌落扩大培养提取质粒后，进行酶切验证，酶切验证结果证明野生型及四种缺失型片段成功连接到pFLAG-CMV-2载体中。 三、DNA测序分析 选取菌落PCR及酶切鉴定为阳性的候选克隆进行DNA序列测定分析，结果表明野生型与缺失型基因片段插入pFLAG-CMV-2表达载体后序列正确，其阅读框架没有发生移码改变，表明重组载体成功构建。 四、野生型及缺失型Dpr1蛋白表达检测 野生型与缺失型pFLAG-Dpr1载体分别转染HEK-293细胞培养48 h后，提取细胞总RNA，RT-PCR检测结果显示，野生型与缺失型Dpr1 mRNA均正常转录表达。Western Blot结果表明，缺失型Dpr1 N1、Dpr1 N2蛋白在细胞中成功表达。 结论 论文二PAH蛋白诱导表达、纯化及红细胞血影包埋的研究 苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的氨基酸代谢障碍性疾病之一，属常染色体隐性遗传病。PKU患儿在新生儿期无特异性临床表现，出生三个月后开始出现智力和语言发育障碍，并随年龄增大而加重。患儿头发、肤色浅淡，尿液和汗液中散发出鼠臭味，同时可伴有智力低下、癫痫、精神异常等症状。 PKU主要是由于患者体内苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或活性减低，导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，苯丙氨酸在体内大量堆积，引起中枢神经系统的损伤，带来一系列病理改变。造成PAH活性降低或丧失的主要原因是由于PAH基因发生突变，如点突变、缺失或重复等所引起的。PAH基因定位于12q22-q24.1，mRNA长1356 bp，编码452个氨基酸，构成一个酶单体。PAH酶单体不具有酶催化活性，它需要依靠C末端四聚体结构域形成四聚体才具有活性。PAH发挥功能还依赖于辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的存在。 近年来对PKU的研究越来越深入，其致病机制也越来越明确，但仍无相对完善的治疗手段。临床上治疗PKU较为有效的方法是苯丙氨酸限制饮食法和BH4疗法。低苯丙氨酸饮食是一种传统的、有效的治疗方法，但无苯丙氨酸的食品口感较差，患者的生活质量会随之下降。BH4补充疗法并非对所有的PKU患者均有疗效，它只适用于BH4缺乏型的PKU患者。基因治疗成为近年来研究热点，但其仍面临一些问题，比如缺乏有效的转移系统、转移的目的基因不能长期表达、宿主免疫反应等。本实验在体外诱导表达了PAH蛋白，将其纯化与复性后，成功包埋到红细胞血影中，为进一步研究应用包埋有PAH蛋白的红细胞血影治疗PKU小鼠的可行性提供了条件。 材料方法 一、pET-PAH、pET-GFP原榱表达载体的构建 分别以pCMV6-XL4-PAH、pEGFP-N3载体为基础，通过PCR、酶切回收、连接、转化、质粒提取等步骤构建pET-PAH、pET-GFP原核表达载体，通过测序证实重组载体成功构建。 二、PAH、GFP蛋白的诱导表达与纯化 将构建成功的pET-PAH、pET-GFP重组载体转化Rosetta感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至A600为0.5-1时，加入终浓度为1mmol/L IPTG，IPTG诱导表达4h后，收集菌体。利用Ni-NTA Agarose试剂盒(QIAGEN)纯化PAH、GFP蛋白。 三、红细胞血影包埋PAH、GFP蛋白 抽取新鲜小鼠血液，利用红细胞血影蛋白包装完全试剂盒（GENMED）将纯化的GFP蛋白包埋到红细胞血影中;PAH蛋白经蛋白质重折叠试剂盒（TaKaRa）复性后，包埋于红细胞血影中。 实验结果 一、pET-PAH、pET-GFP原榱表达载体构建结果 经测序鉴定，pET-PAH与pET-GFP重组原核表达载体中目的基因序列正确，阅读框没有发生移码改变，载体构建成功。 二、PAH、GFP蛋白诱导表达与纯化 将pET-PAH、pET-GFP质粒转化至Rosetta感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB培养液中培养，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测结果表明，转化有pET-PAH、pET-GFP质粒的Rosetta感受态细胞可高效表达分子量分别为52.8 kDa的PAH蛋白和32.8 kDa的GFP蛋白。利用Ni-NTAAgarose试剂盒对PAH、GFP蛋白分别进行纯化，SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色检测结果表明，纯化后得到单一的PAH和GFP蛋白条带，无杂蛋白。 三、红细胞血影包埋PAH、GFP蛋白结果 利用红细胞血影蛋白包装完全试剂盒首先将纯化后的GFP蛋白包埋到红细胞血影中，荧光显微镜检测结果显示，GFP蛋白成功包埋到红细胞血影中。以同样方法将复性后的PAH蛋白包埋于红细胞血影中，用于下一步治疗PKU的研究中。 结论 通过构建pET-PAH、pET-GFP原核表达载体，在体外诱导表达了PAH、GFP蛋白，并成功将纯化后的GFP蛋白和复性后的PAH蛋白包埋到红细胞血影中。

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摘要

英文缩略语

论文一 野生型及缺失型pFLAG-Dpr1载体的构建

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文二 PAH蛋白诱导表达、纯化及红细胞血影包埋的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新性的自我评价

综述 苯丙酮尿症的相关研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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