川西高原自然发酵牦牛酸奶中乳酸菌遗传多样性及优良菌株筛选

摘要

采用16SrDNA-PCR-RFLP和16～23SrDNA的ISR-PCR-RFLP分析技术研究了分离自川西高原自然发酵牦牛酸奶子中的82株乳酸菌和11株参比菌株的遗传多样性，并用16SrDNA基因序列分析技术研究了供试菌株与参比菌株的系统发育关系。在对82株供试菌株的单株发酵乳的口感比对，酸度测定、凝乳时间的基础上，筛选出6株凝乳质量好，具有良好口感的乳酸菌株，并对其发酵特性及系统发育关系进行了研究，结果如下：
　　 1.16SrDNA基因扩增产物的酶切分析表明，在用于酶切试验的5种酶中，MspI酶切条带最丰富，所揭示的遗传信息量大，能很好地揭示供试菌株的遗传多样性。依酶切结果聚类和代表菌株的系统发育关系研究结果，供试菌株在61％相似水平上可分为4个类群，类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ为主要类群，类群Ⅰ和Ⅳ菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)，类群Ⅱ为肠球菌属(Enterococcus)。如果按81％的相似系数聚类，供试菌株可聚类16个群。酶切结果显示，供试菌株共有23种16SrDNA遗传型，其中编号为1，3，7和15的遗传型是主要遗传型，编号为7的遗传型共40株，占供试菌株的42％。4个16SrDNA主要遗传型(编号1、3、7和15)，在按61％相似水平的聚类中，编号1、3和15的三个主要遗传型16SrDNA菌株是第Ⅰ类群的主要菌株；编号为7的遗传型菌株全部为第Ⅳ群菌株。按照81％相似水平聚类的分群结果，对各类群代表菌株进行16SrDNA序列分析，供试菌株中可能有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarun)或戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、干酪乳杆菌群(LactobacilluscaseiGroup)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)以及耐久肠球菌(Enterococcusdurans)等类群。
　　 2.依供试菌株的16SrDNA基因酶切分析聚类的各类群代表菌株的系统发育研究结果表明，代表菌株与典型菌株的16SrDNA基因序列的相似度基本都在98％以下，显示出川西高原牦牛乳酸奶子中的乳酸菌类群比较特殊，可能具有新的种类或种以下的新分类单元。结合16SrDNA基因序列分析和聚类分析，显示分离自川西高原牦牛酸奶子的乳酸菌有比较丰富的遗传多样性，这将为筛选优良菌株提供较丰富的材料。
　　 3.16S～23SrDNA基因的ISR扩增产物的酶切分析表明，供试菌株共有19种ISR遗传型，在用于酶切试验的5种酶中，HinfI酶切条带最丰富，能很好地反映出揭示供试菌株的遗传多样性。如果按60％的相似系数，供试菌株可分为4个类群，如果按80％的相似系数，供试菌株可分为14个类群。19种ISR遗传群中，第二遗传群是主要遗传群。依据ISR扩增产物的酶切的聚类结果，与16SrDNA基因扩增产物的酶切聚类有较大差异，可能与选择的内切酶有关。4.试验通过单株凝乳感官品评，筛选出六株发酵凝乳时间短，感官品质良好的乳杆菌。结合16SrDNA系统发育研究结果和6株菌株产酸特性、凝乳冷藏稳定性、产粘能力和产乙醛能力的研究结果，六株乳杆菌中菌株SAUE-1和SAUE-5可用于进一步筛选酸乳生产的发酵剂菌种。6株筛选菌株的16SrDNA序列分析结果表明，SAUE-1可能为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarun)，SAUE-5和SAU4-7可能为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)或植物乳杆菌(Lactobacillusplantarun)，SAUJ-2可能为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei;SAU4-1和SAUB-2可能为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。

目录

文摘

英文文摘

1 文献综述

1.1 乳酸茵概述

1.2 国内酸奶发酵剂的研究和生产现状

1.2.1 国内商业发酵剂的使用现状

1.2.2 国内酸奶发酵剂的研究现状

1.3 乳酸菌生物多样性研究及系统发育研究

1.3.1 乳酸菌系统发育和分类概述

1.3.2 乳酸菌系统发育研究

1.4 本研究项目立题背景和研究意义

2 材料和方法

2.1 供试菌株及来源

2.2 菌株总DNA提取

2.3 16S rDNA的PCR-RFLP分析

2.3.1 16S rDNA基因扩增

2.3.2 16S rDNA的PCR产物的酶切

2.3.3 16S rDNA的全序列分析

2.4 16S～23S的ISR-PCR-RFLP分析

2.4.1 16S～23S的ISR扩增

2.4.2 16S～23S的ISR扩增产物的酶切分析

2.5 优良菌株的筛选和系统发育研究

2.5.1 菌株筛选

2.5.2 发酵特性研究

2.5.3 筛选菌株的16S rDNA基因序列分析

3 结果与分析

3.1 供试菌株的遗传多样性分析

3.1.1 总DNA提取质量

3.1.2 16S rDNA的PCR-RFLP分析

3.1.3 供试菌株的ISR扩增产物的酶切分析

3.2 优良菌株发酵特性和系统发育研究

3.2.1 菌株筛选

3.2.2 筛选菌株的发酵特性

3.2.3 六株乳杆菌的16S rDNA基因序列分析

4 讨论

4.1 供试菌株的遗传多样性研究

4.1.1 16S rDNA基因扩增产物的酶切分析

4.1.2 16S～23S rDNA的ISR扩增产物的酶切分析

4.1.3 分离菌株的遗传多样性

4.2 供试菌株优良菌株筛选和系统发育研究

4.2.1 供试菌株的感官品评和酸度测定

4.2.2 筛选单株发酵性能研究

4.2.3 筛选单株的16S rDNA基因序列分析

4.2.4 上述研究结果表明

4.3 川西高原自然发酵酸奶子中的乳酸菌群分析和利用前景

4.3.1 川西高原酸奶子中的微生物菌群分析

4.3.2 川西高原牦牛酸奶子中乳酸菌资源利用

参考文献

攻读学位期间发表论文：

致谢