酶解大豆蛋白功能特性、结构及在肉糜中的应用

摘要

本论文应用胰蛋白酶水解大豆分离蛋白提高乳化性能，并且分析了酶解产物的功能性质，不同分子量酶解大豆蛋白的S-S和C-H的连接类型、酪氨酸的暴露情况及其二级结构的差别。探索了温度场对于复合蛋白凝胶的分子作用力的影响和复合肉蛋白体系中的肌纤维蛋白与大豆蛋白及其酶解产物的互作效应。优化了冷冻肉糜的工艺参数，为开发高品质的冷冻猪肉糜制品奠定基础。主要研究成果如下：
　　1.研究了应用胰蛋白酶水解大豆分离蛋白，浊度法测定不同酶解条件下水解产物的乳化活性及乳化稳定性。酶解时间、加酶量、pH值、酶解温度和底物浓度，对乳化活性及乳化稳定性的影响。实验表明:各因素对乳化性均有较大影响；通过四因素二次回归正交旋转组合实验，得到最佳乳化活性酶解大豆蛋白的水解工艺条件。当加酶量、温度、时间与pH的分别为2.72%、40.3℃、4.1h和8.85时，乳化活性值最大，为22.57m2/g。较大豆分离蛋白底物提高了67%。
　　2.研究了不同分子量组成的酶解大豆蛋白的乳化特性、表面疏水性、分子柔性、氨基酸组成、二级结构，S-S和C-H的连接类型、酪氨酸的暴露情况。并对最佳乳化性的酶解产物组成进行了分析。6-10kDa寡肽的乳化活性最大。20kDa以下大豆肽的乳化活性优于大豆分离蛋白。超滤掉寡肽能显著提高酶解产物的乳化活性。4-6kDa寡肽的乳化稳定性最好。蛋白质与肽混合物的乳化稳定性和表面疏水性优于单一肽类物质或蛋白质。2-20kDa大豆肽分子柔性最大。10kDa以上酶解大豆蛋白表面疏水性最大。大豆蛋白或酶解蛋白的表面疏水性优于大豆肽，此外，比较不同分子量的大豆肽，6-10kDa寡肽的表面疏水性最大。6kDa以下大豆寡肽的酸性氨基酸含量显著少于其他分子量的蛋白质或肽；6kDa以下寡肽的疏水性氨基酸和必需氨基酸含量显著大于其他分子量的蛋白质或肽。拉曼光谱和园二色谱共同表征：山东禹王产的大豆分离蛋白仅仅含有β-折叠和无规则卷曲两种结构。酶解大豆分离蛋白具有α-螺旋、β-折叠，β-转角和无规则卷曲四种结构。酶解过程都会影响蛋白质的结构。超滤导致水解产物α-螺旋结构消失。6kDa以上酶解大豆蛋白的酪氨酸暴露在极性环境，但是大豆蛋白或6kDa以下寡肽的酪氨酸包埋在疏水环境中。酶解大豆蛋白经过6kDa和10kDa超滤膜分离后，6-10kDa寡肽含量占37.4%。
　　3.采用Sephadex G-200凝胶柱层析和纤维素DE-52离子交换柱层析法，探索了纯化Saio法提取的大豆7S球蛋白的工艺条件。实验表明：Saio法提取的大豆7S球蛋白是凝胶色谱纯。采用SDS-PAGE和毛细管电泳两种方法鉴定了Saio法提取的大豆7S球蛋白的纯度，纯度为81.38%。
　　4.分别应用大豆分离蛋白、大豆7S球蛋白、酶解大豆蛋白、10-100kDa大豆肽和0.5-10kDa寡肽与猪肉肌纤维蛋白质复合。当加热温度20-75℃时，采用浊度法表征复合凝胶中的非特异性作用力、静电作用力、氢键、疏水相互作用和二硫键大小变化。低于60℃时，加入寡肽的混合蛋白胶的凝胶强度最大；当高于65℃时，加入大豆分离蛋白混合蛋白胶具有最好凝胶强度。非特异性作用力从大到小分别是加入0.5-10kDa寡肽、10-100kDa大豆肽、酶解大豆蛋白、大豆7S球蛋白、大豆分离蛋白。加入0.5-10kDa寡肽和10-100kDa大豆肽的混合蛋白胶具有较高的静电作用力。开始阶段氢键没变化，当温度高于55℃时，五种混合蛋白胶中的氢键含量都开始减少。当20-75℃时，疏水相互作用先增大后减少。疏水相互作用和静电作用力与加入酶解大豆蛋白的蛋白胶的凝胶强度呈正相关；而疏水相互作用和非特异性作用力与其他四种混合蛋白胶呈正相关。
　　5.分别加入大豆分离蛋白、7S球蛋白、酶解大豆蛋白、0.5-10kDa寡肽和10-100kDa大豆肽与猪肉肌纤维蛋白进行复合。比较了复合蛋白凝胶的乳化特性和动态流变性质。实验表明：加入25%的10-100kDa大豆肽的复合蛋白凝胶体系的乳化活性最高；加入25%的大豆7S球蛋白的复合凝胶体系的乳化稳定性最高。此外，加入0.5-10kDa寡肽、酶解大豆蛋白和大豆分离蛋白的混合蛋白胶具有良好的流变性。加入0.5-10kDa寡肽的复合蛋白凝胶具有好的粘度性能，加入酶解大豆蛋白的复合蛋白凝胶具有好的弹性性能，而加入大豆分离蛋白的复合蛋白凝胶两者兼具。
　　6.应用响应面分析方法研究了三聚磷酸钠，转谷氨酰胺酶和酶解大豆蛋白对猪肉糜的质构，蒸煮损失和感官性能影响。转谷氨酰胺酶显著加强猪肉糜的凝胶强度和弹性(P＜0.05和P＜0.01)，酶解大豆蛋白降低猪肉糜的凝胶强度和弹性（P＜0.001和P＜0.01）。酶解大豆蛋白降低(P＜0.001)猪肉糜的内聚性和咀嚼性，其二次项边际效应为正(P＜0.01)。转谷氨酰胺酶与酶解大豆蛋白交互作用提高(P＜0.01)猪肉糜的内聚性。此外，加入转谷氨酰胺酶显著提高(P＜0.01)猪肉糜的咀嚼性。三聚磷酸钠与酶解大豆蛋白交互作用降低(P＜0.05)猪肉糜的咀嚼性。加入酶解大豆蛋白(P＜0.01)与转谷氨酰胺酶（P＜0.05）有利于降低猪肉糜的蒸煮损失。内聚性和咀嚼性显著地影响蒸煮损失，感官硬度，感官弹性和感官湿润性。
　　7.应用Box-Behnken响应面分析法确定猪肉糜制品的最佳持水性生产参数，并研究冻藏过程中对猪肉糜品质和水分状态的影响。分别以猪肉糜凝胶的质构特性、离心脱水率、冻结水含量和凝胶微观表面形态作为考察指标。研究结果：当添加转谷氨酰胺酶为5.48%，酶解大豆蛋白为3.4%和三聚磷酸钠为0.217%时，猪肉糜最大持水性为34.90%。并且冻藏对猪肉糜制品凝胶特性有显著影响。经过90天冻藏后，猪肉糜凝胶硬度下降21.6%，而弹性上升了181.01%。经过90天冻藏，猪肉糜的离心脱水率和冻结水含量分别上升了14%和9%。冻藏过程中猪肉糜凝胶微观表面形态发生明显的劣化。

目录

声明

缩略语表

第一章 前言

1大豆蛋白研究概况

2大豆蛋白水解研究

3蛋白质与大豆肽分离纯化方法

4蛋白质作用机理

5 键合相互作用力

6 外源添加物对肉糜凝胶的影响

7 冻藏对猪肉糜凝胶特性的影响

8 本课题研究的主要内容

第二章 大豆分离蛋白酶解产物乳化特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第三章 大豆分离蛋白，7S球蛋白与不同分子量酶解蛋白功能特性及结构研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第四章Saio法提取大豆7S球蛋白的纯化及鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第五章 温度场对猪肉肌纤维蛋白和大豆蛋白及其酶解蛋白复合凝胶的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第六章 猪肉肌纤维蛋白和大豆蛋白及其酶解蛋白互作效应研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第七章TG酶、大豆多肽及多聚磷酸盐对猪肉糜凝胶性能和结构影响研究

1 材料与方法

2结果与分析

3 小结

第八章 冻藏对猪肉糜凝胶特性影响的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第九章 结论与展望

1 结论

2 展望

3 创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文