SiLCYE调控玉米黄质等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用

摘要

本发明公开了提高谷子玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质含量的方法，所述方法包括通过抑制或降低谷子中蛋白质编码基因的表达量，和/或，抑制或降低谷子中所述的蛋白质的活性和/或含量，来提高谷子中玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质的含量；所述蛋白质为SiLCYE蛋白。通过同源克隆技术克隆了SiLCYE。SiLCYE氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO.2所示。通过CRISPR‑Cas9编辑技术获得SiLCYE基因的编辑株系，通过代谢组学分析明确了这两个基因在谷子类胡萝卜素代谢反应中的调控作用，为揭示谷子类胡萝卜素代谢途径调控机制及培育富含类胡萝卜素高营养品质的谷子新种质提供了实验基础和基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及SiLCYE蛋白调控玉米黄质等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用。

背景技术

类胡萝卜素是人体必需的营养元素，具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老、保护视力等独特的营养保健功效，因此加强谷物中类胡萝卜素的含量，促进其代谢吸收是一项很有必要的研究工作。类胡萝卜素种类很多，被发现的天然类胡萝卜素已达700多种，根据化学结构的不同可以将其分为两类：一类是胡萝卜素(只含碳氢两种元素，如β-胡萝卜素和番茄红素)；另一类是叶黄素(除了碳氢元素，还有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团如叶黄素和虾青素等)。其中含量较大的类胡萝卜素包括β-胡萝卜素(占总类胡萝卜素的质量分数为25％～30％)、叶黄素(40％～50％)、紫黄素(15％)和新黄质(15％)；微量类胡萝卜素包括α-胡萝卜素、玉米黄质、花药黄素和5，6-环氧叶黄素。粮食作物中最重要的类胡萝卜素是β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄素、玉米黄质和番茄红素。谷子(Setariaitalica)是起源于我国的古老农作物，其具有抗旱耐贫瘠，营养丰富，易蒸煮烹饪特性，在我国农业种植结构调整、产业结构优化和人们膳食结构改良中发挥着举足轻重的作用，深受市场欢迎。叶黄素就是小米即谷子籽粒一个重要的营养品质指标，也是一个重要的外观品质指标。

类胡萝卜素生物合成途径在拟南芥、水稻、小麦、玉米、辣椒、番茄和橙子等植物中得到了深入研究，但在谷子中的研究鲜见报道。尽管类胡萝卜素生物合成途径相对保守，但是迄今为止，几乎不同物种甚至每个物种的不同组织类胡萝卜素生物合成的转录调节因子不同，值得进一步深入解析调控网络及每个调控因子的功能。已有研究表明：番茄红素β-环化酶(LCYB)和番茄红素ε-环化酶(LCYE)是番茄红素代谢途径中一个重要分支点的两个调控基因，它们能把番茄红素进行分解形成带β环和ε环的胡萝卜素，产生具有维生素A活性的类胡萝卜素的量，则取决于两种环化酶LCYB和LCYE的相对水平。目前为止关于LCYE的研究相对较少，在谷子中对LCYE的研究还鲜见报道。

发明内容

本申请的目的是提供SiLCYE蛋白调控类胡萝卜素合成的功能以及该功能在谷子新种质创制上的应用，例如：如何快速、高效的制备富含玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质的谷子。为实现上述目的，本申请的第一个方面是提供蛋白质或调控基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在提高谷子籽粒中玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质为SiLCYE蛋白；

所述SiLCYE蛋白是如下a1)-a3)任一种蛋白质：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且与谷子类胡萝卜素相关的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由540个氨基酸残基组成。

所述蛋白质来源于谷子。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

表1：标签的序列

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

进一步地，上述的方法中，所述抑制或降低谷子中蛋白质编码基因的表达量，和/或，抑制或降低谷子中所述的蛋白质的活性和/或含量，通过将CRISPR/Cas9系统导入谷子实现，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子的重组表达载体。

CRISPR/Cas9包括两个部分：一个向导RNA(gRNA)和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associated endonuclease即Cas9)。向导RNA是一个短的合成RNA，由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。

进一步地，上述的方法中，所述gRNA的靶标序列如序列表中序列3第171-190位所示，即5′-GAAGCACGATGAGACGGCGG-3′。

gRNA的靶向(targeting)序列编码基因为序列表中序列4第705-724位所示。

进一步地，上述的方法中，所述抑制或降低谷子中蛋白质编码基因的表达量，和/或，抑制或降低谷子中所述的蛋白质的活性和/或含量为将序列表中序列2进行下述任一种突变：

b1)将序列表中序列2所示的SiLCYE基因突变为SiLCYE/+1bp，所述SiLCYE/+1bp是在序列表中序列2第187至188位核苷酸之间插入一个核苷酸T，保持序列2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；

b2)将序列表中序列2所示的SiLCYE基因突变为SiLCYE/-1bp，所述SiLCYE/-1bp是将序列表中序列2第186位核苷酸G缺失，保持序列2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；

b3)将序列表中序列2所示的SiLCYE基因突变为SiLCYE/-3bp，所述SiLCYE/-3bp是将序列表中序列2第183至185位之间的核苷酸GAC缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

为实现上述目的，本申请的第二个方面是提供上述方法获得的突变蛋白质及其相关生物材料。所述蛋白质为SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp，

所述蛋白质SiLCYE/+1bp为由SiLCYE/+1bp基因编码的蛋白质，所述SiLCYE/+1bp是在序列表中序列2第187至188位核苷酸之间插入一个核苷酸T，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述蛋白质SiLCYE/-1bp为由SiLCYE/-1bp基因编码的蛋白质，所述SiLCYE/-1bp是将序列表中序列2第186位核苷酸G缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述蛋白质SiLCYE/-3bp为由SiLCYE/-3bp基因编码的蛋白质，所述SiLCYE/-3bp是将序列表中序列2第183至185位之间的核苷酸GAC缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

进一步地，与上述蛋白质SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp相关的生物材料，所述生物材料包括A1)-A7)中任一种，

A1)编码上述蛋白质SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；

A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A5)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A6)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有A2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A7)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有A2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有A3)所述重组载体的转基因植物器官。

进一步地，上述的生物材料中，A1)所述核酸分子为SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp，

所述SiLCYE/+1bp是在序列表中序列2第187至188位核苷酸之间插入一个核苷酸T，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述SiLCYE/-1bp是将序列表中序列2第186位核苷酸G缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述SiLCYE/-3bp是将序列表中序列2第183至185位之间的核苷酸GAC缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

为实现上述目的，本申请第三个方面是提供一种应用，所述应用为M1)或M2)，

M1)上述SiLCYE蛋白或调控基因的表达物质或调控所述SiLCYE蛋白活性和/或含量的物质在调控谷子中玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质中的应用，所述基因编码所述SiLCYE蛋白；

M2)上述的SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp蛋白或调控基因的表达物质或调控所述SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp蛋白活性和/或含量的物质在调控谷子玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质中的应用，所述基因编码所述SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp蛋白。

进一步地，所述的应用中，M1)所述调控基因的表达物质或调控所述SiLCYE蛋白活性和/或含量的物质为如下B1)或B2)所述的生物材料：

B1)抑制或降低上述SiLCYE蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低上述SiLCYE蛋白质的活性的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

M2)所述调控基因的表达物质或调控所述SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp蛋白活性和/或含量的物质为如下A1)-A7)中任一项所述的生物材料：

A1)编码所述SiLCYE/+1bp、SiLCYE/-1bp或SiLCYE/-3bp蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；

A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A5)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A6)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有A2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A7)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有A2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有A3)所述重组载体的转基因植物器官。

进一步地，上述的应用中，B1)所述核酸分子为表达靶向上述SiLCYE蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为上述SiLCYE蛋白编码基因的gRNA。

所述gRNA的靶标序列如序列表中序列3第171-190位所示，即5′-GAAGCACGATGAGACGGCGG-3′。

所述gRNA的靶向(targeting)序列编码基因为序列表中序列4第705-724位所示。

本申请中，所述提高谷子中玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质含量可为提高谷子籽粒中玉米黄质或/和叶黄素硬脂酸酯或/和花药黄质含量。

本申请明确SiLCYE在谷子类胡萝卜素代谢通路的功能及代谢通路位置。首先通过同源克隆技术克隆谷子SiLCYE，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对SiLCYE基因进行编辑，获得编辑株系，通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对编辑纯系以及对应的野生种进行类胡萝卜素各组份含量变化测定，结果发现SiLCYE基因编辑导致了谷子籽粒中玉米黄质、叶黄素硬脂酸酯、花药黄质含量显著提高，而叶黄素和叶黄素棕榈酸酯含量显著降低，说明SiLCYE基因在类胡萝卜素代谢中对这几种类胡萝卜素组份有重要的调控作用。运用分子生物学以及遗传学等技术手段，调节SiLCYE基因的内源表达量，有望获得富含玉米黄质、叶黄素硬脂酸酯、花药黄质和叶黄素和叶黄素棕榈酸酯的谷子新种质。。

附图说明

图1为含有SiLCYE靶标序列的LacZ-U6a-sgRNA表达盒构建流程图。

图2为LacZ-U6a-sgRNA表达盒的PCR扩增。

图3为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的Bsa I酶切。

图4为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE重组载体框架图。

图5为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE重组载体的PCR及酶切鉴定；其中图5中A为质粒PCR鉴定，图5中B为质粒Bsa I酶切鉴定。

图6为具有潮霉素抗性的分化小苗。

图7为SiLCYE转基因阳性株系的PCR分子检测。

图8为SiLCYE的CRISPR/Cas9靶点位置及不同编辑纯系的筛选鉴定；其中，图8中A为SiLCYE的基因结构简图及靶点设计的位置及序列；图8中B为靶序列在PAM前第3个和第4个碱基处插入1个碱基T。图8中C为靶序列缺失3个碱基GAC。图8中D为靶序列缺失1个碱基G。图9为SiLCYE编辑纯系中含量发生显著变化的类胡萝卜素统计分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体在文献“PLoS ONE,2016,11(4):e0154027和MolPlant.2015，8(8):1274-84)”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLsgRNA-OsU6a质粒在文献“PLoS ONE,2016,11(4):e0154027和MolPlant.2015，8(8):1274-84)”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

拟转化受体材料谷子品种Ci846由中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员课题组资源材料并惠赠。Ci846在文献“http://www.setariamodel.cn/#/map”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下面将结合实施案例对本发明进行详细描述，实施例仅用于说明本发明，不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。

实施例1、SiLCYE基因编辑靶点设计

1.1、SiLCYE的的氨基酸序列、编码序列及基因组序列

SiLCYE的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述SiLCYE的编码基因如序列表中序列2所示，SiLCYE的基因组序列如序列表中序列3所示。通过生物信息学分析，SiLCYE基因组共有10个外显子，9个内含子，CDS全长1623bp。

1.2、SiLCYE基因编辑靶点设计

根据谷子SiLCYE基因组序列，通过在线靶点预测网站(

实施例2、pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE重组载体的构建

2.1、LacZ-U6a-sgRNA表达盒的构建

按图1所示sgRNA表达盒构建流程图构建含有SiLCYE基因20bp靶标序列的LacZ-U6a-sgRNA表达盒，该表达盒依次由如下几个元件构成：pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体(PLoS ONE,2016,11(4):e0154027)与LacZ-U6a启动子接头引物序列Cas9U6aF(+)、LacZ-U6a启动子序列、20bpSiLCYE靶标序列、sgRNA序列、sgRNA和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体的接头引物序列gR-Rcas9(-)。该表达盒的核苷酸序列(862bp)如序列表中序列4所示。

构建过程具体如下：

首先如图1所示位置设计4条引物：Cas9U6aF(+)，U6aSiLCYET1，gRSiLCYET1，gR-Rcas9(-)，其中Cas9U6aF(+)引物含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上Bsa I酶切位点6碱基序列以及切点旁侧17bp序列；gR-Rcas9(-)引物也含有Cas9载体上另一个Bsa I酶切位点6碱基序列以及切点旁侧17bp序列。Cas9U6aF(+)，U6aSiLCYET1，gRSiLCYET1，gR-Rcas9(-)，的引物序列如下：

Cas9U6a-F(+)：

5'-CGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'

U6aSiLCYET1：5'-CCGCCGTCTCATCGTGCTTC ggcagccaagccagca-3'

gRSiLCYET1：5'-AAGCACGATGAGACGGCGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3'

gR-Rcas9(-)：5'-CGCGCCAATGATACCGCGAGACCCGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'

以pYLsgRNA-OsU6a质粒为模板，用Cas9U6aF(+)/U6aSiLCYET1和gRSiLCYET1/gR-Rcas9(-)引物对分别扩增。PCR反应体系为ddH2O 19.μl，2xKOD neo buffer 2μl，F-primer0.75μl，R-primer0.75μl，40mM dNTP1μl，KOD Fx neo 0.5ul，OsU6a 2ul，共计50ul。再以两个引物对的PCR扩增产物混合物为模板，以Cas9U6aF(+)/gR-Rcas9(-)引物对进行overlapping。overlapping的PCR反应体系为ddH2O 19.5μl，2xKOD neo buffer 25μl，F-primer 0.75μl，R-primer 0.75μl，40mM dNTP 1μl，KOD Fx neo 0.5ul，OsU6a 2ul，共计50ul，模板为上述两个引物对PCR扩增产物的等量混合液，回收overlapping扩增产物，即为862bp的LacZ-U6a-sgRNA表达盒，overlapping扩增产物进行电泳检测，如图2所示。

图2结果表明，overlapping扩增产物电泳条带在750bp与1000bp之间，与扩增产物的大小862bp一致。

2.2、LacZ-U6a-sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体同源重组

将pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体用Bsa I酶切后回收大片段载体，如图3所示，将该大片段线性载体与2.1得到的LacZ-U6a-sgRNA表达盒进行同源重组，LacZ-U6a-sgRNA表达盒就构建入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体Bsa I两个切点位置处，从而获得重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE，如图4所示。具体重组方法步骤参见：Takara Bio USA，Inc.

将获得的重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE进行PCR和酶切鉴定，确保构建的sgRNA表达盒序列正确，并正确连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H的两个Bsa I切点位置处。首先将重组的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE载体进行大肠杆菌DH10B化学感受态细胞转化，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。具体方法步骤可参照庄盟生物科技有限公司ZOMANBIO的TOP10F`感受态细胞Cat.NO.ZC1029的说明书。

挑取单克隆至1ml含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇培6-8h，收取菌液进行质粒提取，具体方法步骤可参照博迈德生物科技有限公司Biomed的质粒小量快速提取试剂盒BM191220进行质粒提取。

随后进行菌液PCR和质粒酶切鉴定，以载体上的测序引物即载体上sgRNA表达盒接入前后序列SP-L1/SP-R引物对进行扩增，阳性克隆具有大小为983bp的特异扩增条带，见图5中A所示。PCR反应体系为：ddH

图5结果表明：PCR扩增目的条带大小以及酶切片段大小均与预期大小相同，说明SiLCYE的sgRNA表达盒成功构建在pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。

载体测序引物为：

SP-L1：5'-GCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3'；

SP-R：5'-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3'。

实施例3、SiLCYE阳性转基因谷子的获得及编辑株系鉴定

3.1、Ci846成熟胚愈伤组织培养以及pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE农杆菌菌株EHA105介导的愈伤转化

拟转化受体材料谷子品种Ci846由中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员课题组资源材料并惠赠。

按照博迈德生物科技有限公司(Biomed)EHA105农杆菌感受态细胞试剂说明书(产品编号BC303-01)将重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE导入到EHA105感受态细胞中，获得含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE质粒的农杆菌菌株。

利用谷子Ci846的成熟胚作为外植体进行愈伤组织诱导培养，及含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYE质粒的农杆菌菌株的侵染转化实验委托中国农业科学院作物科学研究所转基因中心完成，该中心对外开放谷子的遗传转化服务。通过该中心实验获得大量具有潮霉素抗性的分化苗，如图6所示。

3.2、SiLCYE转基因阳性株系以及编辑株系鉴定

将上述分化小苗移入土里继续生长，首先进行真正阳性转基因株系的PCR分子鉴定，在明确阳性转基因株系的基础上再进行编辑株系的分子鉴定。鉴定阳性转基因阳的引物对为Cas9-f/Cas9-r，扩增大小为572bp，引物序列分别为：Cas9-f：CTGACGCTAACCTCGACAAG；Cas9-r：CCGATCTAGTAACATAGATGACACC。图7展示了部分转基因株系Cas9-f/Cas9-r分子检测结果。

由图7看出：检测的转基因株系中绝大多数是真正的转基因株系，也有部分株系是假阳性。

在SiLCYE基因基因组靶点位置上下游合适位置设计引物对HiTomSiLCYEF1/HiTomSiLCYER1，扩增片段大小为237bp。将Cas9-f/Cas9-r引物鉴定的阳性转基因株再通过HiTomSiLCYEF1/HiTomSiLCYER1引物对PCR分子检测，PCR扩增产物送睿博生物科技有限公司测序，确定基因组DNA中SiLCYE靶点位置序列是否发生变化，从而明确该基因是否被编辑。HiTomSiLCYEF1/HiTomSiLCYER1的序列分别为：

HiTomSiLCYEF1：5'-ggagtgagtacggtgtgcAGGGCGGAGGTGGAGAGGTG-3'

HiTomSiLCYER1：5'-gagttggatgctggatggCTTGGAGGCGATCTTGGAC-3'

通过生物信息学分析，SiLCYE基因共有10个外显子，9个内含子，CDS全长1623bp。通过CRISPR靶点分析软件分析，我们把第一个外显子第171bp-190bp共20bp作为靶点序列，图8中A所示为靶点序列。经过T0和T1代编辑株系的筛选鉴定，共获得29个编辑纯系，获得如图8中B，C，D所示：插入1个碱基，缺失3个碱基和缺失1个碱基3种编辑形式的编辑纯系。经分析图8中B和图8中D两种编辑形式会严重影响插入和缺失位点后碱基的正常翻译，发生了移码变异，RNA表达以及蛋白的正常翻译会严重受到影响，图8中C三碱基缺失在缺失位点后不会发生移码变异，整个序列会影响2个氨基酸的正常翻译，1个氨基酸正常翻译，1个氨基酸缺失。

图8中A，SiLCYE的基因结构简图及靶点设计的位置及序列；图8中B，图8中C和图8中D展示的是编辑纯系中三种不同的编辑形式，左边是野生型序列与编辑序列的一致性比对情况，上面序列为野生型序列，下面为编辑序列，红框圈的是20bp的靶点位置序列，右边为编辑株系对应的靶点及前后序列的测序图谱。

图8中B显示在靶点序列插入1个T碱基，在基因组的变化为在序列表中序列3第187至188位核苷酸之间插入一个核苷酸T，保持序列3的其他核苷酸序列不变，其编码序列为在序列表中序列2第187至188位核苷酸之间插入一个核苷酸T，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该DNA分子命名为SiLCYE/+1bp，导致翻译的蛋白质在突变位点后产生移码突变，获得突变后蛋白质命名为SiLCYE/+1bp。

图8中C显示在靶点序列缺失3个碱基，在基因组的变化为在序列表中序列3第183至185位之间的核苷酸GAC缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变，其编码序列为在序列表中序列2第183至185位之间的核苷酸GAC缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该DNA分子命名为SiLCYE/-3bp，导致翻译后的蛋白质氨基酸缺失突变，获得突变后蛋白质命名为SiLCYE/-3bp。

图8中D显示在靶点序列缺失1个G碱基，在基因组的变化为在序列表中序列3第186位的核苷酸G缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变；其编码序列为在序列表中序列2第186位的核苷酸G缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该DNA分子命名为SiLCYE/-1bp，导致翻译后的蛋白质在突变位点后产生移码突变，获得突变后蛋白质命名为SiLCYE/-1bp。

实施例4、SiLCYE在类胡萝卜素合成代谢中的调控作用

通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术，我们检测了实施例3中的鉴定的SiLCYE编辑纯系以及受体Ci846中类胡萝卜素成分的含量变化。选取3个生物学重复，即选取3个SiLCYE编辑纯系系和3株野生型Ci846共计6份谷子材料种子脱皮后的类胡萝卜素含量变化。测定近70种类胡萝卜素成分的含量变化，采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，含量发生显著变化的有如下6种类胡萝卜素组分，结果见图9。实验结果以平均值±标准偏差表示，图9中P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

图9结果表明叶黄素、叶黄素硬脂酸酯、叶黄素棕榈酸酯、花药黄质和玉米黄质5种类胡萝卜素组分在SiLCYE编辑株系含量与野生型受体材料相比发生了显著变化。其中，叶黄素和叶黄素棕榈酸酯的含量较野生型显著降低了(图9)，玉米黄质、叶黄素硬脂酸酯、花药黄质和的含量均提高了(图9)，说明SiLCYE对这5种类胡萝卜素组分的代谢有重要的调控作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

中国农业科学院生物技术研究所

<120> SiLCYE调控玉米黄质等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> PRT

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

Met Gly Leu Ser Gly Ala Ala Ile Ser Ala Pro Leu Gly Cys Arg Gly

1 5 10 15

Leu Pro His Gly Ala Val Gly Gly Gly Ser Lys Val Arg Arg Ala Glu

20 25 30

Val Glu Arg Trp Arg Arg Arg Glu Gly Ala Gly Arg Arg Val Ala Gly

35 40 45

Pro Lys Val Arg Cys Val Ala Thr Glu Lys His Asp Glu Thr Ala Ala

50 55 60

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala Asp Glu Glu Asp Tyr

65 70 75 80

Arg Lys Gly Gly Gly Gly Glu Leu Leu Tyr Val Gln Met Gln Ala Thr

85 90 95

Lys Pro Met Glu Ser Gln Ser Lys Ile Ala Ser Lys Leu Leu Pro Ile

100 105 110

Ser Asn Glu Asn Ser Val Leu Asp Leu Val Ile Ile Gly Cys Gly Pro

115 120 125

Ala Gly Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ala Lys Lys Gly Leu Thr Val

130 135 140

Gly Leu Ile Gly Pro Asp Leu Pro Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp

145 150 155 160

Glu Asp Glu Phe Lys Asp Leu Gly Leu Glu Ser Cys Ile Glu His Val

165 170 175

Trp Lys Asp Thr Ile Val Tyr Leu Asp Asn Asn Glu Pro Ile Leu Ile

180 185 190

Gly Arg Pro Tyr Gly Arg Val His Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu

195 200 205

Leu Arg Arg Cys Tyr Glu Ala Gly Val Thr Tyr Leu Asn Ser Lys Val

210 215 220

Asp Lys Ile Ile Glu Ser Pro Asp Gly His Arg Val Val Cys Cys Glu

225 230 235 240

Arg Gly Arg Glu Ile Leu Cys Arg Leu Ala Ile Val Ala Ser Gly Ala

245 250 255

Ala Ser Gly Arg Leu Leu Glu Tyr Glu Val Gly Gly Pro Arg Val Cys

260 265 270

Val Gln Thr Ala Tyr Gly Val Glu Val Glu Val Glu Asn Asn Pro Tyr

275 280 285

Asp Pro Ser Leu Met Val Phe Met Asp Tyr Arg Asp Cys Phe Lys Glu

290 295 300

Lys Phe Ser His Ser Glu Gln Glu Asn Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met

305 310 315 320

Pro Met Ser Ser Thr Arg Val Phe Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser

325 330 335

Lys Asp Ala Met Pro Phe Asp Val Leu Lys Lys Arg Leu Met Tyr Arg

340 345 350

Leu Asp Ala Met Gly Val Arg Ile Leu Lys Val His Glu Glu Glu Trp

355 360 365

Ser Tyr Ile Pro Val Gly Gly Ser Leu Pro Asn Thr Asp Gln Lys Asn

370 375 380

Leu Ala Phe Gly Ala Ala Ala Ser Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr

385 390 395 400

Ser Val Val Arg Ser Leu Ser Glu Ala Pro Arg Tyr Ala Ser Val Ile

405 410 415

Ser Asp Ile Leu Arg Asn Arg Val Pro Ala Gln Tyr Leu Pro Gly Ser

420 425 430

Ser Gln Asn Tyr Ser Pro Ser Met Leu Ala Trp Arg Thr Leu Trp Pro

435 440 445

Gln Glu Arg Lys Arg Gln Arg Ser Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu

450 455 460

Ile Ile Gln Leu Asn Asn Glu Gly Ile Gln Thr Phe Phe Glu Ala Phe

465 470 475 480

Phe Arg Val Pro Lys Trp Met Trp Arg Gly Phe Leu Gly Ser Thr Leu

485 490 495

Ser Ser Val Asp Leu Ile Leu Phe Ser Phe Tyr Met Phe Ala Ile Ala

500 505 510

Pro Asn Gln Leu Arg Met Asn Leu Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro

515 520 525

Thr Gly Ser Thr Met Ile Lys Thr Tyr Leu Thr Leu

530 535 540

<210> 2

<211> 1623

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 2

atggggctct cgggcgcggc gatctccgcg ccgctcggct gccgcgggct gccgcacggg 60

gcggtcggcg gaggcagcaa ggtgcggagg gcggaggtgg agaggtggcg gcggcgggag 120

ggcgcgggcc ggcgcgtggc cggaccgaag gtgaggtgcg tggcgaccga gaagcacgat 180

gagacggcgg cggtcggggc ggcggcggcg ggcgtggagt tcgcggacga ggaggactac 240

cgcaaggggg gcggcggcga gctgctctac gtgcaaatgc aggccaccaa gcccatggaa 300

agccagtcca agatcgcctc caagctgctg cccatatcca atgaaaattc agtacttgat 360

ctggttatca ttggctgtgg tcctgccggt ctttctctag cttcagagtc agccaagaaa 420

ggcctcactg ttggtcttat tggccctgac cttccgttca cgaataacta tggtgtgtgg 480

gaggatgaat tcaaagatct tggtctagag agctgtattg agcatgtctg gaaggatacc 540

attgtctatc tagacaataa tgaaccaata ctgattggcc gtccatatgg cagggtgcac 600

cgtgacctgc tgcatgagga gttgctgaga agatgctatg aagctggcgt tacatacctc 660

aactcgaaag tggacaagat catcgaatct ccagatggtc atagagtagt ctgttgtgaa 720

aggggccgtg agatactctg taggcttgcg attgttgctt cgggggcagc atctggtcgg 780

cttttagaat acgaggttgg aggtccccgt gtctgtgtgc agactgcata tggagtagaa 840

gttgaggtgg aaaacaatcc atatgatccc agcttaatgg ttttcatgga ctacagagat 900

tgtttcaaag agaaattctc gcattctgaa caagaaaatc caactttcct gtatgctatg 960

cctatgtcat ccacacgagt tttctttgag gaaacatgct tagcctctaa agatgcgatg 1020

ccctttgatg tacttaagaa aaggttgatg tatcggttgg atgcaatggg agttcggatc 1080

ctgaaagttc atgaggagga atggtcctac attcctgttg gaggttcctt accaaataca 1140

gatcagaaaa atcttgcatt tggtgctgca gcaagtatgg tgcaccctgc aactggctac 1200

tcagtggtca gatctttgtc tgaggctcca agatatgcct ctgtaatatc agatatctta 1260

aggaaccgag ttcctgcgca atatttgcca ggaagttctc aaaattacag tccatcaatg 1320

cttgcttgga gaacactatg gcctcaagaa aggaaacggc aacgctcatt tttccttttc 1380

ggattggcat tgatcatcca actgaataat gaaggcatac aaacattctt cgaagccttt 1440

ttcagggtgc cgaaatggat gtggcgaggg ttcttgggct caaccctttc atcggtagat 1500

ctaatactat tttcattcta catgtttgcg atagctccga atcaattgcg aatgaacctc 1560

gtcagacatc tactctctga tccgaccggc tcaacaatga tcaagaccta cctgaccttg 1620

taa 1623

<210> 3

<211> 3700

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 3

atggggctct cgggcgcggc gatctccgcg ccgctcggct gccgcgggct gccgcacggg 60

gcggtcggcg gaggcagcaa ggtgcggagg gcggaggtgg agaggtggcg gcggcgggag 120

ggcgcgggcc ggcgcgtggc cggaccgaag gtgaggtgcg tggcgaccga gaagcacgat 180

gagacggcgg cggtcggggc ggcggcggcg ggcgtggagt tcgcggacga ggaggactac 240

cgcaaggggg gcggcggcga gctgctctac gtgcaaatgc aggccaccaa gcccatggaa 300

agccagtcca agatcgcctc caaggttatt agattactga tactgataat tctctaatca 360

atttctgtgc ttgttctaat gatcatgatt atagatttcg tccccttatc ttgtactagt 420

attttgggat ttactggaca tgaaatccat aacatctgcc actataaact ttgattaaca 480

tgtacgagat aaaattcatg tacatcgaag ctttctattt ctcatttttg cctgtaaccg 540

cacaccattc atattgtcca tccatcagca atcgaacttt atctttttca agagaaataa 600

ccccagccaa gtaggttagg gtaatcattt aagagcgtag taaaatattg cacaattcag 660

tatggaacca cacgcgccgt acttcacgtg ctttggctac aatgacgtcc gtggaaacgg 720

gtggtgatga cttgtccatc tcctcttcgg ctggttgaca cagttgatca tcgtttatgt 780

ccatttggaa gtgtatactg tagtttaaaa gttctgaaat gcattttatc atgaaaatga 840

gagtagctta tcagttttat actattacaa agtgaacatt gtgctgtaac tgtacttgac 900

tgcgatctga aaaatctact taggaactgt cacaagactc aaggtattgt gattggtggg 960

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cacgtcctag ggtgtttgca catgaagatc atgtctcttt ttttctgttt actacttact 1080

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acacacatgg gcatgtcatt tacggtctaa tgtcacgcag tttgactttg ctttaattta 1200

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gattgctcaa acctttgacg gaaacatgtg ctgttaaaaa tatgtgcaca ttaacaatgt 1320

tttagttctt gttttatcgt aaacctattt tcttagggaa tgaagtattt ccttacatga 1380

tgaagtagct aaaaatcgta ctggcatagg ttcgctgtat ggttcaggaa aaatgaatat 1440

gtggtctttt ctttttcgca gctgctgccc atatccaatg aaaattcagt acttgatctg 1500

gttatcattg gctgtggtcc tgccggtctt tctctagctt cagagtcagc caagaaaggc 1560

ctcactgttg gtcttattgg ccctgacctt ccgttcacga ataactatgg tgtgtgggag 1620

gatgaattca aaggtattat attatttgca ttgctacgat gaagagtttt tgcataatat 1680

ctttatcaac ataatttact ttgacgatac ttattctttt ctctcttttt ctgtccagat 1740

cttggtctag agagctgtat tgagcatgtc tggaaggata ccattgtcta tctagacaat 1800

aatgaaccaa tactgattgg ccgtccatat ggcagggtgc accgtgacct gctgcatgag 1860

gagttgctga gaaggtaaat tctcatgtac caatattggg attcaaaagt atgaattacc 1920

aagcaacgtg atatactatg attgacaagt agcaacactt aaatcattgg cagatgctat 1980

gaagctggcg ttacatacct caactcgaaa gtggacaaga tcatcgaatc tccagatggt 2040

catagagtag tctgttgtga aaggggccgt gagatactct gtaggcttgc gattgttgct 2100

tcgggggcag catctggtcg gcttttagaa tacgaggttg gaggtccccg tgtctgtgtg 2160

cagactgcat atggagtaga agttgaggta cacaaagaag ctgttacttt caattcattt 2220

gccatttcat agtttacata atatcagtgc tcattctcgt tcttgatgaa actttcaaca 2280

tagcatttgg ttactagtta tatgttcttt cagaatgatt tgaatttttc aggtggaaaa 2340

caatccatat gatcccagct taatggtttt catggactac agagattgtt tcaaagagaa 2400

attctcgcat tctgaacaag aaaatccaac tttcctgtat gctatgccta tgtcatccac 2460

acgagttttc tttgaggtct gtatggaact tccattacat ctgtgattct acaaccagta 2520

cttccatgct tcaaagtttc cgatcaaatt ctttatcaca ggaaacatgc ttagcctcta 2580

aagatgcgat gccctttgat gtacttaaga aaaggttgat gtatcggttg gatgcaatgg 2640

gagttcggat cctgaaagtt catgaggagg taagaagtta agggtcacta gcatgttcgg 2700

ctatgattct tgccgctgcg ctgcagctgc gcctgcagca ccaacaactc tggttcctgt 2760

agttttagaa ggctagcagc tgcagcaatc tcagccaaac agcttgttaa tttctcattc 2820

atatgtattg tgaacataaa ctgaaatgct gaagcttggt ttcaggaatg gtcctacatt 2880

cctgttggag gttccttacc aaatacagat cagaaaaatc ttgcatttgg tgctgcagca 2940

agtatggtgc accctgcaac tggtatggcc aaatccttaa tttttacaca ccatgtcctt 3000

ccttgcaatc tagctgatat tcacaacgtg ttggaaaatt cataggctac tcagtggtca 3060

gatctttgtc tgaggctcca agatatgcct ctgtaatatc agatatctta aggaaccgag 3120

ttcctgcgca atatttgcca ggaagttctc aaaattacag tccatcaatg cttggtaagt 3180

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cattgatcat ccaactgaat aatgaaggca tacaaacatt cttcgaagcc tttttcaggg 3420

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tactgaaggt aacaatttcc aagaagtttt gacagccatt gttattgtca acaggatgtg 3540

gcgagggttc ttgggctcaa ccctttcatc ggtagatcta atactatttt cattctacat 3600

gtttgcgata gctccgaatc aattgcgaat gaacctcgtc agacatctac tctctgatcc 3660

gaccggctca acaatgatca agacctacct gaccttgtaa 3700

<210> 4

<211> 862

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgccgtag tgctcgagag accctccgtt ttacctgtgg aatcggcagc aaaggacgcg 60

ttgacattgt aggactatat tgctctaata aaggaggcag ctatgctggc cgtcgtttta 120

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 180

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 240

cgcagcctga atggctaatt ttttcctgta gttttcccac aaccattttt taccatccga 300

atgataggat aggaaaaata tccaagtgaa cagtattcct ataaaattcc cgtaaaaagc 360

ctgcaatccg aatgagccct gaagtctgaa ctagccggtc acctgtacag gctatcgaga 420

tgccatacaa gagacggtag taggaactag gaagacgatg gttgattcgt caggcgaaat 480

cgtcgtcctg cagtcgcatc tatgggcctg gacggaatag gggaaaaagt tggccggata 540

ggagggaaag gcccaggtgc ttacgtgcga ggtaggcctg ggctctcagc acttcgattc 600

gttggcaccg gggtaggatg caatagagag caacgtttag taccacctcg cttagctaga 660

gcaaactgga ctgccttata tgcgcgggtg ctggcttggc tgccgaagca cgatgagacg 720

gcgggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 780

aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcaa gagcttggag tggatggaat tttcctccgg 840

gtctcgcggt atcattggcg cg 862