SiLCYB调控番茄红素等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用

摘要

本发明公开了。本发明公开了蛋白质或调控基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控谷子类胡萝卜素中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质为SiLCYB；所述SiLCYB是氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质。通过CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得编辑株系，通过代谢组学分析明确了SiLCYB基因在谷子类胡萝卜素代谢反应中的调控作用，为揭示谷子类胡萝卜素代谢途径调控机制及培育富含类胡萝卜素高营养品质的谷子新种质提供了实验基础和基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及SiLCYB蛋白调控谷子番茄红素等类胡萝卜素合成代谢的功能及应用。

背景技术

类胡萝卜素是人体必需的营养元素，具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老、保护视力等独特的营养保健功效，因此加强谷物中类胡萝卜素的含量，促进其代谢吸收是一项很有必要的研究工作。类胡萝卜素种类很多，被发现的天然类胡萝卜素已达700多种，根据化学结构的不同可以将其分为两类：一类是胡萝卜素(只含碳氢两种元素，如β-胡萝卜素和番茄红素)；另一类是叶黄素(除了碳氢元素，还有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团如叶黄素和虾青素等)。其中含量较大的类胡萝卜素包括β-胡萝卜素(占总类胡萝卜素的质量分数为25％～30％)、叶黄素(40％～50％)、紫黄素(15％)和新黄质(15％)；微量类胡萝卜素包括α-胡萝卜素、玉米黄质素、花药黄素和5，6-环氧叶黄素。粮食作物中最重要的类胡萝卜素是β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄素、玉米黄质和番茄红素。不同类胡萝卜素的抗氧化强度的顺序为：番茄红素>胡萝卜素>隐黄质>玉米黄质＝β-胡萝卜素>叶黄素。番茄红素作为植物性食物中存在的一种类胡萝卜素，具有很高的抗氧化能力，堪称植物黄金。然而天然番茄红素是反式构型，不易被人体吸收利用，这是限制番茄红素应用于营养健康产业的瓶颈问题。研究表明热处理过程可以促进番茄红素由不易被人体吸收的天然反式构型转变成易于被人体吸收的顺式构型。谷子(Setaria italica)是起源于我国的古老农作物，其具有抗旱耐贫瘠，营养丰富，易蒸煮烹饪特性，在我国农业种植结构调整、产业结构优化和人们膳食结构改良中发挥着举足轻重的作用，深受市场欢迎。谷子具有高温蒸煮的烹饪特性，80％以上的谷子用作米粥，如果我们能够利用谷子的这种饮食习惯创制出富含番茄红素等类胡萝卜素的谷子新种质，就会极大提高番茄红素的生物利用效率，来实现富含番茄红素高营养谷子的市场空缺，满足市场需求，进一步增强谷子市场化。在谷子中创制出富含番茄红素的种质资源将对高效利用番茄红素促进国民营养健康具有重要意义。

类胡萝卜素生物合成途径在拟南芥、水稻、小麦、玉米、辣椒、番茄和橙子等植物中得到了深入研究，但在谷子中的研究鲜见报道。尽管类胡萝卜素生物合成途径相对保守，但是迄今为止，几乎不同物种甚至每个物种的不同组织类胡萝卜素生物合成的转录调节因子和调节方式不尽不同，值得进一步深入解析调控网络及每个调控因子的功能。已有研究表明：番茄红素β-环化酶(LCYB)和番茄红素ε-环化酶(LCYE)是番茄红素代谢途径中一个重要分支点的两个调控基因，它们能把番茄红素进行分解形成带β环和ε环的胡萝卜素，产生具有维生素A活性的类胡萝卜素的量，则取决于两种环化酶LCYB和LCYE的相对水平。LCYB发现的时间比LCYE的要早，两者都是在拟南芥中被发现的，但随后LCYB还从辣椒、番茄、柑橘中克隆到。在谷子中，对LCYB的研究还鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是提供SiLCYB蛋白调控类胡萝卜素合成的功能以及该功能在谷子新种质创制上的应用，例如：如何快速、高效的制备富含番茄红素或/和ε-胡萝卜素的谷子。

为实现上述目的，本发明第一个方面是提供蛋白质或调控基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控谷子中番茄红素、ε-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素或/和玉米黄质含量中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质为SiLCYB；

所述SiLCYB是如下a1)-a3)任一种蛋白质：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且与谷子类胡萝卜素相关的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

序列表中序列1由495个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

表1：标签的序列

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

进一步地，上述的应用中，所述谷子可为谷子籽粒。

进一步地，上述的应用中，所述蛋白质来源于谷子。

第二个方面，本发明提供上述蛋白质相关的生物材料在调控谷子中番茄红素、ε-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素或/和玉米黄质含量中的应用，与所述蛋白质相关的生物材料为下述任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；

A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A5)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A6)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有A2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A7)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有A2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A8)抑制或降低上述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性的核酸分子；

A9)含有A8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

进一步地，上述的应用中，A1)所述核酸分子可为如下g1)-g2)任一项所示的DNA分子：

g1)编码链的编码序列为序列表中序列2的DNA分子；

g2)与g1)所述DNA分子具有80％以上的同一性，且编码调控谷子类胡萝卜素相关蛋白的DNA分子；

A8)所述核酸分子为：b1)和/或b2)，

b1)为表达靶向上述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子；

b2)为靶向上述蛋白编码基因的gRNA。

进一步地，上述的应用中，b1)或b2)所述gRNA的靶标序列可为序列表中序列2的第843到862位所示核苷酸，即5′-GCCCACAAGGATCTTCCTCG-3′。

进一步地，上述的应用中，gRNA的靶向(targeting)序列编码基因可为序列表中序列3第705-724所示。

第三个方面，本发明提供产生富含番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量的谷子的方法，所述方法可包括通过抑制或降低谷子中上述的蛋白质的活性或上述基因的表达来产生。

进一步地，上述方法还可包括向野生型植株中导入靶向上述蛋白质编码基因的CRISPR/Cas9编辑系统，所述CRISPER/Cas9编辑系统包含gRNA和Cas9蛋白质。

CRISPR/Cas9包括两个部分：一个向导RNA(gRNA)和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associated endonumclease即Cas9)。向导RNA是一个短的合成RNA，由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。

进一步地，上述的方法中，所述gRNA的靶标序列可为序列表中序列2的第843到862位所示的核苷酸。

进一步地，上述的方法中，gRNA的靶向(targeting)序列编码基因可为序列表中序列3第705-724位所示。

本发明中，所述提高谷子中番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量可为提高谷子籽粒中番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量；所述富含番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量的谷子可为富含番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量的谷子籽粒。

本发明明确了SiLCYB在谷子类胡萝卜素代谢通路的功能。首先通过同源克隆技术克隆谷子SiLCYB，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对SiLCYB基因进行编辑，获得编辑株系，通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对编辑株系以及对应的野生种进行类胡萝卜素各组份含量变化测定，结果发现SiLCYB基因编辑导致了谷子籽粒中类胡萝卜素组分番茄红素或/和ε-胡萝卜素含量显著提高，而α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，叶黄素和玉米黄质含量显著降低，说明SiLCYB基因在类胡萝卜素代谢中对番茄红素或/和ε-胡萝卜素，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，叶黄素和玉米黄质有重要的调控作用。运用分子生物学以及遗传学等技术手段，调节SiLCYB基因的内源表达量，有望获得富含番茄红素、ε-胡萝卜素、α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，叶黄素和玉米黄质的谷子新种质，这个实验结果为我们后续研究富含番茄红素等类胡萝卜素谷子新种质奠定了坚实材料基础和实验依据。

附图说明

图1为含有SiLCYB靶标序列的LacZ-U6a-sgRNA表达盒构建流程图。

图2为LacZ-U6a-sgRNA表达盒的PCR扩增。

图3为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的Bsa I酶切。

图4为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB重组载体框架图；其中，如图4中A表示重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB；图4中B所示为重组载体上sgRNA表达盒的测序引物SP-L1/SP-R引物对。

图5为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB重组载体的PCR及酶切鉴定；其中图5中A为质粒PCR鉴定，图5中B为质粒Bsa I酶切鉴定。

图6为具有潮霉素抗性的分化谷子小苗。

图7为SiLCYB转基因阳性株系的PCR分子检测。

图8为SiLCYB的CRISPR/Cas9靶点位置及编辑株系的筛选鉴定；其中，图8中A为SiLCYB的基因结构简图及靶点设计的位置及序列；图8中B为在PAM前3个碱基开始发生碱基变异，出现双峰，说明靶点序列被正确编辑。

图9为SiLCYB编辑株系中含量发生显著变化的类胡萝卜素统计分析；其中CK表示未被编辑株系，SiLCYB表示SiLCYB编辑株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体在文献“PLoS ONE,2016,11(4):e0154027和MolPlant.2015，8(8):1274-84)”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLsgRNA-OsU6a质粒在文献“PLoS ONE,2016,11(4):e0154027和MolPlant.2015，8(8):1274-84)中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

拟转化受体材料谷子品种Ci846由中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员课题组资源材料并惠赠。Ci846在文献“http://www.setariamodel.cn/#/map”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下面将结合实施案例对本发明进行详细描述，实施例仅用于说明本发明，不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。

实施例1、SiLCYB基因编辑靶点设计

1.1、SiLCYB的氨基酸序列、编码序列及基因组序列

SiLCYB的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述SiLCYB的编码序列和基因组序列如序列表中序列2所示(该基因组中无内含子)。

1.2、SiLCYB基因编辑靶点设计

根据谷子SiLCYB基因组序列，通过在线靶点预测网站(

实施例2、pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB重组载体的构建

2.1、LacZ-U6a-sgRNA表达盒的构建

按图1所示sgRNA表达盒构建流程图构建含有20bp SiLCYB基因靶标序列的LacZ-U6a-sgRNA表达盒，该表达盒依次由如下几个元件构成：pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体(PLoS ONE,2016,11(4):e01540274)与LacZ-U6a启动子接头引物序列Cas9U6aF(+)、LacZ-U6a启动子序列、20bpSiLCYB靶标序列、sgRNA序列、sgRNA和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体的接头引物序列gR-Rcas9(-)。该表达盒的核苷酸序列(862bp)如序列表中序列3所示。

构建过程具体如下：

首先如图1所示位置设计4条引物：Cas9U6aF(+)，U6aSiLCYBT1，gRSiLCYBT1，gR-Rcas9(-)，其中Cas9U6aF(+)引物含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上Bsa I酶切位点6碱基序列以及切点旁侧17bp序列；gR-Rcas9(-)引物也含有Cas9载体上另一个Bsa I酶切位点6碱基序列以及切点旁侧17bp序列。Cas9U6aF(+)，U6aSiLCYBT1，gRSiLCYBT1，gR-Rcas9(-)，的引物序列如下：

Cas9U6a-F(+)：5'-CGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'

U6aSiLCYBT1：5'-CGAGGAAGATCCTTGTGGGCggcagccaagccagca-3'

gRSiLCYBT1：5'-CCCACAAGGATCTTCCTCGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3'

gR-Rcas9(-)：5'-CGCGCCAATGATACCGCGAGACCCGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'

以pYLsgRNA-OsU6a质粒为模板，用Cas9U6aF(+)/U6aSiLCYBT1和gRSiLCYBT1/gR-Rcas9(-)引物对分别扩增。PCR反应体系为ddH

图2结果表明overlapping扩增产物大小为862bp，与LacZ-U6a-sgRNA表达盒的大小一致，扩增出的是目的片段。

2.2、LacZ-U6a-sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体同源重组

将pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体用Bsa I酶切后回收大片段载体(如图3所示)，将该大片段线性载体与2.1得到的LacZ-U6a-sgRNA表达盒进行同源重组，LacZ-U6a-sgRNA表达盒就构建入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体Bsa I两个切点位置处，从而获得重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB，如图4中A所示。具体重组方法步骤参见：Takara Bio USA,Inc.

将获得的重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB进行PCR和酶切鉴定，确保构建的sgRNA表达盒序列正确，并正确连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H的两个Bsa I切点位置处。首先将重组的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB载体进行大肠杆菌DH10B化学感受态细胞转化，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。具体方法步骤可参照庄盟生物科技有限公司ZOMANBIO的TOP10F`感受态细胞Cat.NO.ZC1029的说明书。

挑取单克隆至1ml含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇培6-8h，收取菌液进行质粒提取，具体方法步骤可参照博迈德生物科技有限公司Biomed的质粒小量快速提取试剂盒BM191220进行质粒提取。

随后进行菌液PCR和质粒酶切鉴定，以载体上的测序引物即载体上sgRNA表达盒接入前后序列SP-L1/SP-R引物对(见图4中B所示)进行扩增，阳性克隆具有大小为983bp的特异扩增条带(如图5中A)。PCR反应体系为：ddH

图5结果表明：PCR扩增目的条带大小以及酶切片段大小均与预期大小相同，说明SiLCYB的sgRNA表达盒成功构建在pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。

载体测序引物为：

SP-L1：5'-GCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3'；

SP-R：5'-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3'。

实施例3、SiLCYB阳性转基因谷子的获得及编辑株系鉴定

3.1、Ci846成熟胚愈伤组织培养以及pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB农杆菌菌株EHA105介导的愈伤转化

拟转化受体材料谷子品种Ci846由中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员课题组资源材料并惠赠。按照博迈德生物科技有限公司(Biomed)EHA105农杆菌感受态细胞试剂说明书(产品编号BC303-01)将重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB导入到EHA105感受态细胞中，获得含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB质粒的农杆菌菌株。

利用谷子Ci846的成熟胚作为外植体进行愈伤组织诱导培养，及含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SiLCYB质粒的农杆菌菌株的侵染转化实验委托中国农业科学院作物科学研究所转基因中心完成，该中心对外开放谷子的遗传转化服务。通过该中心实验获得大量具有潮霉素抗性的分化苗，如图6所示。

3.2、SiLCYB转基因阳性株系以及编辑株系鉴定

将上述分化小苗移入土里继续生长，首先进行真正阳性转基因株系的PCR分子鉴定，在明确阳性转基因株系的基础上再进行编辑株系的分子鉴定。鉴定阳性转基因阳的引物对为Cas9-f/Cas9-r，扩增大小为572bp，引物序列分别为：Cas9-F：CTGACGCTAACCTCGACAAG；Cas9-R：CCGATCTAGTAACATAGATGACACC。图7展示了部分转基因株系Cas9-F/Cas9-R分子检测结果。

由图7看出：检测的转基因株系中绝大多数是真正的转基因株系，也有部分株系是假阳性。

在SiLCYB基因基因组靶点位置上下游合适位置设计引物对SiLCYBF1/SiLCYBR1，扩增片段大小为493bp。将Cas9-f/Cas9-r引物鉴定的阳性转基因株再通过SiLCYBF1/SiLCYBR1引物对PCR分子检测，PCR扩增产物送睿博生物科技有限公司测序，确定基因组DNA中SiLCYB靶点位置序列是否发生变化，从而明确该基因是否被编辑。SiLCYBF1/SiLCYBR1的序列分别为：SiLCYBF1:5-GCCTCGTGCAGTACGACAAACC-3；SiLCYBR1:5-GTGTCGAGGAACCGCACAATGG-3。

通过测序比对及图谱分析共获得40多株编辑株，但均为编辑杂合株系，编辑株基本是在NGG前第3位和第4位碱基位置进行准确编辑，编辑形式为大片段缺失或单碱基插入或碱基替换，所有编辑株测序图谱反应形式如图8所示在NGG(PAM位点)前第4个碱基位置开始出现双峰。

实施例4、SiLCYB在类胡萝卜素合成代谢中的调控作用

通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术，我们检测了实施例3中鉴定的SiLCYB编辑株系以及受体Ci846中类胡萝卜素成分的含量变化。选取3个生物学重复，即选取3个SiLCYB编辑株系和3株野生型Ci846共计6份谷子材料种子脱皮后的类胡萝卜素含量变化。测定近70种类胡萝卜素成分的含量变化，采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，含量发生显著变化的有如下5种类胡萝卜素组分，结果见图9。实验结果以平均值±标准偏差表示，图9中P＜0.05(*)表示具有显著性差异。

由图9看出：相比于野生型，番茄红素和ε-胡萝卜素含量显著提高，而α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，叶黄素、和玉米黄质4种类胡萝卜素组分在SiLCYB编辑株系含量显著降低，说明SiLCYB对这6种类胡萝卜素组分的代谢有重要的调控作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

中国农业科学院生物技术研究所

<120> SiLCYB调控番茄红素等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

Met Ala Ala Thr Ala Leu Leu Leu Arg Thr His His Gln Pro Cys Lys

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Arg Ala Ala Val Leu Cys Arg

20 25 30

Ala Ala Ala Gly Thr Ser Ala Gly Pro Ala Ser Ala Ala Ala Leu Arg

35 40 45

Ser Leu Ala Pro Pro Thr Gln Pro Glu Leu Leu Ser Leu Asp Leu Pro

50 55 60

Arg Tyr Asp Pro Ser Arg Ala Arg Pro Val Asp Leu Ala Val Val Gly

65 70 75 80

Gly Gly Pro Ala Gly Leu Ala Val Ala Gln Arg Val Ala Glu Ala Gly

85 90 95

Leu Ser Val Cys Ala Ile Asp Pro Ser Pro Ala Leu Val Trp Pro Asn

100 105 110

Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu Phe Glu Ala Met Gly Leu Ser His

115 120 125

Cys Leu Asp Thr Val Trp Pro Ser Ala Ser Val Phe Ile Gly Asp Gly

130 135 140

Ala Ser Pro Lys Ser Leu Asp Arg Pro Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg

145 150 155 160

Lys Leu Lys Ser Ala Met Met Asp Arg Cys Val Ala Asn Gly Val Val

165 170 175

Phe His Gln Ala Lys Val Ala Lys Ala Val His His Asp Ala Ser Ser

180 185 190

Leu Leu Ile Cys Asp Asp Gly Val Ala Val Pro Ala Thr Val Val Leu

195 200 205

Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg Cys Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr

210 215 220

Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala Tyr Gly Ile Leu Ala Glu Val Asp Gly

225 230 235 240

His Pro Phe Asp Ile Asp Lys Met Leu Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser

245 250 255

His Leu Pro Glu Gly Ser Glu Ile Lys Glu Arg Asn Arg Arg Ile Pro

260 265 270

Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Ser Pro Thr Arg Ile Phe Leu Glu

275 280 285

Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg Pro Gly Leu Ala Met Asp Asp Ile Gln

290 295 300

Glu Arg Met Ala Ala Arg Leu Arg His Leu Gly Ile Arg Val Arg Ser

305 310 315 320

Val Glu Glu Asp Glu Arg Cys Val Ile Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro

325 330 335

Val Leu Pro Gln Arg Val Val Gly Ile Gly Gly Thr Ala Gly Met Val

340 345 350

His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala Arg Thr Leu Ala Thr Ala Pro

355 360 365

Ile Val Ala Asp Ala Ile Val Arg Phe Leu Asp Thr Gly Gly Gly Ala

370 375 380

Ala Gly Leu Thr Gly Asp Ala Leu Ser Ala Glu Val Trp Lys Gln Leu

385 390 395 400

Trp Pro Ala Asn Arg Arg Arg Gln Arg Glu Phe Phe Cys Phe Gly Met

405 410 415

Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Glu Gly Thr Arg Arg Phe Phe Asp

420 425 430

Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro His Tyr Trp His Gly Phe Leu Ser Ser

435 440 445

Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu Leu Met Phe Gly Leu Thr Leu Phe Gly

450 455 460

Asn Ala Ser Asn Thr Ser Arg Leu Glu Ile Met Ala Lys Gly Thr Val

465 470 475 480

Pro Leu Gly Lys Met Ile Gly Asn Leu Ile Gln Asp Arg Asp Gly

485 490 495

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 2

atggccgcca ccgccctcct cctccgcacc caccaccaac cctgcaagcc gccgccgccg 60

cctccccccg cggcgcgcgc agccgtcctc tgccgcgccg cggcggggac gtccgccggg 120

ccggcgtcgg ccgcggcgct gcggtccctg gccccgccca cgcagccgga gctgctgtcc 180

ctcgacctcc cccgctacga cccatcgcgc gcccgccccg tggacctcgc cgtggtgggc 240

ggcgggcccg cgggcctcgc cgtggcgcag cgcgtggcgg aggccggact ctccgtgtgc 300

gccatcgacc cgtccccggc gctcgtgtgg cccaacaact acggcgtgtg ggtggacgag 360

ttcgaggcca tgggcctctc ccactgcctc gacaccgtct ggccgtcggc gtccgtcttc 420

atcggcgacg gcgccagccc caagtcgctc gaccgcccct acgcccgcgt cgcgcgccgg 480

aagctcaagt ccgccatgat ggaccgctgc gtcgccaacg gcgtcgtctt ccaccaggcc 540

aaggtcgcca aggccgtcca ccacgacgcc tcctccctcc tcatctgcga cgacggcgtc 600

gccgtcccgg ccaccgtcgt gctcgacgcc acggggttct cccgctgcct cgtgcagtac 660

gacaaaccat ataaccccgg ctaccaggtc gcctacggca tcctcgccga ggtcgacggc 720

cacccgttcg acatcgacaa gatgctcttc atggactggc gcgactcgca cctcccggag 780

gggtcggaga tcaaagagcg caaccgccgc atccccacgt tcctctacgc catgcccttc 840

tcgcccacaa ggatcttcct cgaggagacg tccctcgtcg cgcgcccggg cctcgccatg 900

gacgacatcc aggagcgcat ggctgcgcgg ctcaggcacc tggggatacg cgtccggagc 960

gtcgaggagg acgagcggtg cgtcatcccc atgggcgggc cgctgcccgt gctgccgcag 1020

agggtcgtcg gcatcggcgg cacggccggg atggtgcacc cgtccacggg gtacatggtg 1080

gcgcgcacgc tggcgaccgc gccaatcgtg gcggacgcca ttgtgcggtt cctcgacacc 1140

ggcggcggcg cggcgggact caccggggac gcgctctccg ccgaggtgtg gaagcagctg 1200

tggccggcca acaggcggcg gcagagggag ttcttctgct tcggcatgga catcctgctc 1260

aagctcgacc tcgaggggac gcgccgcttc ttcgacgcct tcttcgacct cgagccgcac 1320

tactggcacg gcttcctgtc gtccaggctg ttcctgccgg agctcctgat gttcgggctc 1380

acgctgttcg ggaacgcctc caacacgtcc aggctcgaga tcatggccaa gggcaccgtg 1440

cctcttggca agatgattgg caacttgata caggacagag atgggtga 1488

<210> 3

<211> 862

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcgccgtag tgctcgagag accctccgtt ttacctgtgg aatcggcagc aaaggacgcg 60

ttgacattgt aggactatat tgctctaata aaggaggcag ctatgctggc cgtcgtttta 120

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 180

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 240

cgcagcctga atggctaatt ttttcctgta gttttcccac aaccattttt taccatccga 300

atgataggat aggaaaaata tccaagtgaa cagtattcct ataaaattcc cgtaaaaagc 360

ctgcaatccg aatgagccct gaagtctgaa ctagccggtc acctgtacag gctatcgaga 420

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ggagggaaag gcccaggtgc ttacgtgcga ggtaggcctg ggctctcagc acttcgattc 600

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ctcggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 780

aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcaa gagcttggag tggatggaat tttcctccgg 840

gtctcgcggt atcattggcg cg 862