一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法

摘要

本发明属于糖化蛋白检测技术领域，尤其是涉及一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：取一定体积的溴甲酚紫溶液在比色皿中；将待测血清样本加入到溴甲酚紫溶液中；通过测定585nm的吸光度来得到总蛋白浓度CT；将苯硼酸吸附剂加入到比色皿中与BCP‑GA发生反应；等待吸附剂完全沉积在比色皿底部；测定585nm的吸光度来得到非糖化血清白蛋白的浓度Cng，并通过公式(CT‑Cng)/CT*100％计算出糖化血清白蛋白的比例。本发明在碱性条件下用溴甲酚紫测试总白蛋白含量，白蛋白与溴甲酚紫结合后吸光度下降，白蛋白含量与吸光度下降值呈线性关系，并且全部测试都通过吸光光度法完成，试剂稳定，检测快速、简便，与医院通用设备完全兼容。

说明书

技术领域

本发明涉及糖化血清白蛋白检测技术领域，尤其涉及一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法。

背景技术

半个世纪以来中国经济持续快速发展，人民物质生活水平不断提高。相当一部分人由于饮食习惯和饮食结构不合理，加之缺乏足够运动，糖尿病的发病率快速增高，近几年尤甚。目前中国已经有1亿的糖尿病患者，而且还没有减缓的趋势，这种情况得不到有效抑制，若干年后会产生严重的社会问题。

目前检测糖化血清白蛋白含量的方法步骤复杂，或者耗时，或者酶和抗体蛋白稳定性差，因此还未能在临床获得广泛使用。

经检索中国专利号104198472公开了一种利用酶法测定糖化血清白蛋白的试剂盒，他们先将对白蛋白特异性的蛋白酶将糖化白蛋白反应成糖化氨基酸，接着用糖化氨基酸氧化酶(KAOD)与糖化氨基酸反应生成葡萄糖酮醛、氨基酸和过氧化氢，生成的过氧化氢在色原和4-氨基安替比林的共存下会与过氧化氢酶定量的变化成蓝紫色色素，通过测定蓝紫色的吸光度来定量糖化白蛋白，再接着用溴甲酚紫法定量总白蛋白，从而确定这两种物质的比例。

另外中国专利号104345150公开了一种检测糖化白蛋白的免疫层析试纸条，他们通过利用金属卟啉标记抗白蛋白抗体和羊抗鼠IgG抗体与糖化白蛋白结合，再利用试纸层析法对糖化和非糖化血清白蛋白进行分离，并测量总白蛋白和荧光标记物结合糖化血红蛋白的荧光，从而确定这两种物质的比例。

而硼酸亲和法广泛应用于糖化血红蛋白的分离检测。美国专利编号5631364和7374943以及国际专利号2014-033258公开了一种方法，他们将与染料结合的硼酸衍生物与糖化血红蛋白反应，利用试纸层析法对糖化和非糖化血清白蛋白进行分离，并测量总血红蛋白和染料结合糖化血红蛋白的反射率(％)，从而确定这两种物质的比例。

为了解决现有方法存在的一些问题，我们提出一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取一定体积的溴甲酚紫溶液在比色皿中；

S2、将待测血清样本加入到溴甲酚紫溶液中，形成BCP-BSA；

S3、通过测定585nm的吸光度来得到总血清白蛋白浓度C

S4、将苯硼酸吸附剂加入到比色皿中与BCP-GA发生反应,形成MP-GA-BCP；

S5、等待吸附剂完全沉积在比色皿底部；

S6、测定585nm的吸光度来得到非糖化血清白蛋白的浓度C

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述步骤S1、S2和S3是在碱性性条件下即pH>9的状态下获得溴甲酚紫溶液585nm的吸光度A0，并且加入血清样本后总白蛋白与BCP形成复合物，测定吸光度A1，由A0-A1计算得到总血清白白蛋白含量C

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述步骤S4、S5和S6中通过可以选择性结合糖化白蛋白的苯硼酸试剂将其与非糖化白蛋白分离，再次测定585nm吸光度A2，由A2-A1计算得到非糖化白蛋白的含量C

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述测定糖化血清白蛋白方法包括：

(a)将血样加入到溴甲酚紫检测液当中，让总血清白蛋白与溴甲酚紫充分反应形成BCP-HSA；

(b)使用分光光度计在585nm对总血清白蛋白定量；

(c)将偶连苯硼酸基团的微球加入到已和溴甲酚紫反应的溶液中，让苯硼酸微球与BCP-GA特异性结合并充分反应形成微球-GA-BCP；

(d)MP-GA-BCP因为重力会在一分钟后沉降在底部；

(e)使用分光光度计在585nm对非糖化的血清白蛋白进行定量；

(f)通过测定出来的总血清白蛋白和非糖化血清白蛋白来计算糖化血清白蛋白比例。

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，可以将偶连苯硼酸基团的微球直接加入到溶液当中测定。

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，也可以用磁珠偶连苯硼酸基团加入到溶液中与糖化血清白蛋白结合，再用磁力分离测定。

在上述的利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法中，所述测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，还可以将微球填充到细管中利用针筒进行测定。

与现有技术相比，本一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法的优点在于：

1、本发明的特征在于在碱性条件下用溴甲酚紫测试总白蛋白含量，白蛋白与溴甲酚紫结合后吸光度下降，白蛋白含量与吸光度下降值呈线性关系；

2、本发明的另一特征在于在碱性条件下苯硼酸衍生物与糖化白蛋白通过酯键结合，吸光度增大，糖化白蛋白含量与吸光度增大值呈线性关系；

3、本发明的另一特征在于全部测试都通过吸光光度法完成，试剂稳定，检测快速、简便，与医院通用设备完全兼容。

附图说明

图1为本发明提出的一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法的方法框图；

图2为本发明提出的一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法的测定糖化血清白蛋白的步骤图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

参照图1-2，一种利用硼酸亲和原理来检测糖化血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取一定体积的溴甲酚紫溶液在比色皿中；

S2、将待测血清样本加入到溴甲酚紫溶液中；

S3、通过测定585nm的吸光度来得到总蛋白浓度C

S4、将苯硼酸吸附剂加入到比色皿中与BCP-GA发生反应；

S5、等待吸附剂完全沉积在比色皿底部；

S6、测定585nm的吸光度来得到非糖化白蛋白的浓度C

其中，步骤S1、S2和S3是在碱性性条件下即pH>9的状态下获得溴甲酚紫溶液585nm的吸光度A0，并且加入血清样本后总白蛋白与BCP形成复合物，测定吸光度A1，由A0-A1计算得到总白蛋白含量C

进一步的，步骤S4、S5和S6中通过可以选择性结合糖化白蛋白的苯硼酸试剂将其与非糖化白蛋白分离，再次测定585吸光度A2，由A2-A1计算得到非糖化白蛋白的含量C

其中，测定糖化血清白蛋白方法包括：

(a)将血样加入到溴甲酚紫检测液当中，让总血清白蛋白与溴甲酚紫充分反应形成BCP-HSA；

(b)使用分光光度计在585nm对总血清白蛋白定量；

(c)将偶连苯硼酸基团的微球加入到已和溴甲酚紫反应的溶液中，让苯硼酸微球与BCP-GA特异性结合并充分反应形成微球-GA-BCP；

(d)微球-GA-BCP因为重力会在一分钟后沉降在底部；

(e)使用分光光度计在585nm对非糖化的血清白蛋白进行定量；

(f)通过测定出来的总血清白蛋白和非糖化血清白蛋白来计算糖化血清白蛋白比例。

其中，测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，可以将偶连苯硼酸基团的微球直接加入到溶液当中测定，具体的，测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，也可以用磁珠偶连苯硼酸基团加入到溶液中与糖化血清白蛋白结合，再用磁力分离测定，更具体的，测定非糖化血清白蛋白比例的方法中，还可以将微球填充到细管中利用针筒进行测定。

具体的实施方式为：

1-1对总血清白蛋白的测定：

将2ml含有80μmol/L

1-2对非糖化血清白蛋白的测定：

将5μl(70％)的苯硼酸微球加入到1-1的溶液里，充分反应两分钟，待微球全部沉积在比色皿底部时，利用分光光度计(尤尼柯7200型)测定波长为585nm的吸光度，再用BCP法的标准曲线对非糖化血清白蛋白进行定量得到C

最后，利用公式(C

实施例2

与实施例1的不同之处在于：

该方法的重复率

批内重复性试验：取同一血清样本，同时连续重复检测20次，计算出CV值。批间重复性试验：将同一血清样本分装成20份，贮存于冰箱，每天取1份检测，共20天,，计算出CV值。批内CV值、批间(日间)CV值按照美国临床试验室标准化委员会(NCCLS)文件要求的批内、批间不精密度水平应小于5％，该方法符合要求。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。