应用于液相芯片检测食品中多种有害物质的提取方法

摘要

本发明涉及应用于液相芯片技术检测食品中沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、克伦特罗(Clenbuterol，CLE)、莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)、呋喃西林(Furacilin，SEM)、苏丹红I(Sudan I，SUD1)、有机磷农药(Organophosphorus pesticide，DPA)六种有害物质的提取方法。本发明通过对不同种类不含有目标残留物质的样品中添加一定浓度的目标残留标准物质，以建立的提取方法对检测样品进行提取并建立的液相芯片系统检测目标物质，试验结果表明本提取方法回收率较高，同时对液相芯片检测无干扰，可应用于液相芯片的检测。具有较强的实用性。

说明书

技术领域

本发明涉及应用于液相芯片技术检测食品中沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、克伦特罗(Clenbuterol，CLE)、莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)、呋喃西林(Furacilin，SEM)、苏丹红I(Sudan I，SUD1)、有机磷农药(Organophosphorus pesticide，DPA)六种有害物质的提取方法。

背景技术

近几十年，随着人们对食品与环境质量认识和要求的提高，由农药、兽药、生物毒素等残留物引起的食品安全问题越来越受到人们的关注。为了保证食品安全，促进国际农副产品贸易的发展，联合国粮农组织(FA0)、世界卫生组织(WHO)以及世界各国政府高度重视农药、兽药、食品添加剂等残留问题。同时，世界各国将最高残留限量作为农副产品国际贸易中的重要技术壁垒。WHO/FAO制定的限量标准有2510项，欧盟、美国和日本等世界各国也制定了各类食品的限量标准，同时，世界各国还不得不痛苦地承受食品中农药、兽药、食品添加剂等残留量超标带来的严重损失，并且，给人民健康也带来了极大的危害，残留物超标危害的严重性和持久性已成为国际社会关注的焦点。

对于农药、兽药、食品添加剂等残留的检测。由于其种类多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，尤其是近年来，高效、低毒、低残留农、兽药品种和新发现生物毒素的不断涌现，对食品中多残留物的检测技术提出了更高的要求。目前用于检测有害残留物质的方法多以单项目的化学检测、生化检测和生物检测方法为主，所涉及的食品中有害物质的提取也多以针对某一种检测方法和检测目标物而建立的提取方法为主。急需提供一种快速、高通量、灵敏可靠的药物残留平行筛选技术，以应对不断增长变化的检测项目。因此，从技术成熟程度和检测需求上综合考虑，以微量免疫分析、光电技术为基础的液相悬浮式芯片检测技术因其检测快速、灵敏和高通量等特点是开发食品中多残留高通量平行检测系统的良好通用平台，而建立适用于该方法的有效快速并且能同时提取食品中多种残留物质的提取方法是该技术能有效利用的基础和关键技术。

发明内容

本发明的目的在于建立应用于液相芯片技术检测食品中沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、克伦特罗(Clenbuterol，CLE)、莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)、呋喃西林(Furacilin，SEM)、苏丹红I(Sudan I，SUD1)、有机磷农药(Organophosphorus pesticide，DPA，AOVA)六种有害物质的提取方法。

本发明提供的应用于液相芯片技术检测食品中沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、呋喃西林、苏丹红I、有机磷农药六种有害物质的提取方法是：将待测样品中按1ml乙腈/1g样品的比例，加入乙腈，经过匀浆和超声波处理后离心分离得到滤液，滤液在保护气体下浓缩至近干，将近干样品用甲醇溶解后进行液相芯片检测。

根据本发明的实施例，样品用乙腈溶解后，匀浆的条件是：10000rpm下匀浆10min后；超声波处理时间是2h，期间每20min-30min取出混匀一次。

上述离心分离的优选条件是：2500rpm离心5min。

根据本发明的实施例，优选上述离心分离后的残渣继续用乙腈提取一至两次，合并滤出液；将滤出液在4000rpm条件下离心5min，取上清溶液于45±5℃氮气流下浓缩至近干，将近干样品用甲醇溶解后进行液相芯片检测。

本发明通过对不同种类不含有目标残留物质的样品中添加一定浓度的目标残留标准物质，以建立的提取方法对检测样品进行提取并建立的液相芯片系统检测目标物质，试验结果表明本提取方法回收率较高，同时对液相芯片检测无干扰，可应用于液相芯片的检测。具有较强的实用性。

附图说明

图1苏丹红液相色谱检测结果图；

图2样本中只添加苏丹红经本发明方法提取后，进行液相芯片检测结果；

图3在样本中添加沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺后液相色谱检测结果图；

图4在样本中添加呋喃西林后液相色谱检测结果图；

图5在样本中添加有机磷农药后气相色谱检测结果图；

图6同时检测样本中六种有害物质的液相芯片结果图。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

应用于液相芯片检测食品中六种有害物质的提取方法的研究。

实施例1

一、样本的制备和提取

分别取经检测不含待检目标残留物的不同食品(表1)各3份。

表1模拟试验样品残留物含量表(mg/kg)

取处理的试样10g于匀浆瓶中，分别按照表1中终量加入各目标残留物标准品，混匀，制备成含有待测物的待测样品。按照本发明的方法对待测样本进行提取，并按照现有的不同项目检测方法(见下面的说明)的要求进行纯化，并进行高效液相色谱(HPLC)和气相色谱检测计算三次平行样品的平均值和其回收率，检测结果见表2。

所说的本发明的提取方法是：10g待测样品中加入10mL乙腈，在10000rpm下匀浆10min后置超声波清洗器中超声2h(期间每20min-30min取出混匀一次)，超声后冷却至室温；2500rpm离心5min，上清液用布氏漏斗抽虑到50mL离心管中，残渣用2×2.5mL乙腈提取液混匀抽滤两次，合并滤出液；将滤出液4000rpm离心5min，取上清溶液于(45±5)℃氮气流下浓缩至近干。

二、苏丹红成分的纯化和检测

将含有苏丹红的样本1按本发明的方法进行提取后，按照以下方法进行纯化后，液相色谱法检测其苏丹红含量，并计算其回收率。

苏丹红纯化方法：

1)将氮气流下浓缩得到的近干样品加入2mL正己烷溶解，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸；

2)用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱，控制氧化铝表层吸附的色素带宽小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液；

3)用含5％丙酮的正己烷液60mL洗脱；

4)收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后供液相色谱测定。

液相色谱检测结果图1：检测结果表明只含有苏丹红的情况下，按照本发明方法进行样品提取后进行液相芯片法检测，只有苏丹红检测结果为阳性，说明该提取方法有效并且对其它项目的检测不产生干扰。参比液相色谱检测结果说明该提取方法回收率高，适合于食品中苏丹红的提取。

同时对样本2直接提取未纯化的提取物进行液相芯片检测。采用苏丹红阳性标准品(2mg/kg)作为阳性对照；采用0.1mol/L pH＝7.2的PBS作为阴性对照；采用已知不含有六种有害物质的样本同时提取做为阴性对照样本，同时进行提取后直接进行液相芯片检测。检测结果如图2所示，A1孔为阳性对照，B1孔为样品检测，C1孔为阴性对照，D1孔为阴性对照样品。

三、沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺的纯化和检测。

将样本2进行提取后，按照以下方法进行纯化后液相色谱法检测其沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺含量，并计算其回收率。

沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺纯化方法：

1)将氮气流下浓缩得到的近干样品用盐酸-甲醇溶液溶解后，每次加5mL正己烷于混匀器上混匀1min，1500r/min离心5min后，用尖嘴吸管将有机相去掉，共处理二次；

2)保留的水相用2.0mol/L NaOH溶液，调节pH至12，用3×5mL乙酸乙酯-正丁醇溶液抽提水相，每次混匀2min，于2500r/min离心5min后，用尖嘴吸管将上层有机相取到另一离心管中；

3)将合并的乙酸乙酯-正丁醇抽提溶液于(70±5)℃氮气流下浓缩至近干，用1mL盐酸-甲醇溶液溶解残渣。

4)将两根SCX小柱串联接好安装在真空抽滤装置上，保持洗脱流速为1mL/min，依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 0.030mol/L盐酸溶液活化小柱；将1mL样品提取液加到小柱上；再用1mL盐酸-甲醇溶液洗涤试管并一起转移至小柱中；依次用5mL水、5mL甲醇淋洗小柱。在溶剂流过固相萃取柱后，保持真空抽气状态至少保持5min。

5)于真空装置下放好刻度收集管，用5mL 4％氨甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液。将洗脱液于(70±5)℃氮气流下浓缩至近干，用甲醇溶解残渣并定容至2.0mL，过0.45μm滤膜后，供液相色谱测定。液相色谱检测结果图3。

在对添加有终浓度为10mg/kg的沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺的样品2进行提取后并纯化后，采用HPLC检测，三种兽药残留物质均被检出，检测结果和回收率见表2。

四、呋喃西林的纯化和检测

将样本2进行提取后，按照以下方法进行纯化后液相色谱法检测其呋喃西林含量，并计算其回收率。

呋喃西林纯化方法：

1)用1.0mL乙酸乙酯溶解近干样品，同时加入pH值至7-7.5的蒸馏水，混摇1min，2500r/min离心3min；

2)离心分层后，有机相移至另一离心管中，水相用8mL乙酸乙酯再提取一次，弃去水相，合并有机相；

3)有机相在50℃空气流下吹干。用定容液定容至1.0mL，通过0.45um滤膜过滤至样品瓶中，供液相色谱测定。

4)用1.0mL乙酸乙酯溶解近干样品，同时加入pH值至7-7.5的蒸馏水，混摇1min，2500r/min离心3min；

5)离心分层后，有机相移至另一离心管中，水相用8mL乙酸乙酯再提取一次，弃去水相，合并有机相；

6)有机相在50℃空气流下吹干。用定容液定容至1.0mL，通过0.45um滤膜过滤至样品瓶中，供液相色谱测定。

呋喃西林液相色谱检测结果图4。

在对添加有终浓度为300mg/kg呋喃西林的样品进行提取后，采用HPLC检测，样本中的呋喃西林被检出，检测结果和回收率见表2。

五、有机磷农药的纯化和检测。

将含有有机磷农药的样本按本发明方法进行提取后，按照以下方法进行纯化后，用气相色谱法检测其有机磷农药含量，并计算其回收率。

有机磷农药纯化方法：

1)加入2.0ml乙酸乙酯溶解近干样品，在混匀器上充分混匀2min，全部过活性碳小柱；

2)用4.0ml乙酸乙酯洗脱；

3)用2.0ml乙酸乙酯+正己烷(1+1)洗脱；

4)合并洗脱液，40℃氮气流下浓缩至0.5ml，供气相色谱分析，以外标法峰面积定量。

有机磷农药气相色谱检测结果图5。

在对添加有终浓度为10mg/kg有机磷农药的样品进行提取后，采用气相色谱进行检测，样本中有机磷农药被检出，检测结果和回收率见表2。

表2添加标准物质样品检测结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

六、六种残留物质同时检测

采用本发明的方法对同时含有六种残留物质的样本进行提取后，采用六种阳性标准品(10mg/kg)作为阳性对照，采用0.1mmol/L pH＝7.2的PBS作为阴性对照，采用已知不含有六种有害物质的样本同时提取作为样本阴性对照，应用已包被好的六种残留物质抗原的液相芯片检测用微球对得到的提取物进行检测结果表明：该提取方法对六种残留物质进行直接提取适用于液相芯片快速检测六种有害物质(图6)。图中A1孔为检测背景，B1孔为阳性对照检测孔，C1孔为样本检测孔，D1孔为阴性对照。

通过采用液相色谱和气相色谱法对提取得到的六种残留物质进行比对说明该提取方法的回收率高，液相芯片的检测结果证明该提取方法适用于液相芯片法同时检测食品中沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、克伦特罗(Clenbuterol，CLE)、莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)、呋喃西林(Furacilin，SEM)、苏丹红I(Sudan I，SUD1)、有机磷农药(Organophosphorus pesticide，DPA，AOVA)六种有害物质。