基于aptamer--光子晶体微球液相芯片技术检测农产品中多种真菌毒素的研究

摘要

真菌毒素是粮食等农产品中常见的污染物，而且农产品中常常同时存在多种真菌毒素，这对人类健康已造成严重威胁。目前，国内外关于真菌毒素的检测方法较多，但它们往往存在工作量大、成本高，试剂损耗多等不足。本论文选取了具有代表性的真菌毒素（赭曲霉毒素A和伏马毒素B1）作为检测对象，利用三维光子晶体微球作为液相芯片载体，基于核酸适配体识别技术和荧光分析技术建立一种高通量、高灵敏度、低成本并可同时检测多种真菌毒素的新方法。具体开展的工作如下: （一）利用实验室自制微流控装置，制备出尺寸均一、大小可控的二氧化硅光子晶体微球，利用光纤光谱仪测量不同种微球的反射峰位置，实现微球编码。试验对微球表面的功能化进行了研究，以增强其与生物分子的结合能力，并且使功能化后微球的荧光背景达到最低，减小误差，使有利于下一步的检测研究。 （二）以光子晶体微球为液相芯片载体，基于核酸适配体技术和荧光分析技术建立了农产品中的赭曲霉毒素A(OTA)的检测方法。通过对试验反应条件的优化，最终确定OTA-aptamer序列浓度为400 nmol/L，其荧光标记互补序列浓度为500 nmol/L，杂交条件为37℃下反应2h，OTA结合反应条件为37℃下反应1h。利用最佳反应条件，制作出OTA的单重检测标准曲线，线性范围为1-0.001 ng/mL，线性方程为y=992.61+224.35x，R2=0.994。特异性试验结果显示，方法特异性强，与黄曲霉毒素B1(AFB1)、伏马毒素B1(FB1)并无明显交叉反应。最后在三种不同农产品中添加不同浓度的OTA进行回收率测定，其回收率分别为:大米73.73±2.39％～106.90±5.37％、玉米90.67±5.27％～125.17±2.31％、小麦87.91±5.26％～119.55±7.82％。 （三）在研究（二）的基础上，建立了农产品中的两种毒素(OTA、FB1)的同时检测方法。通过将微球表面包被不同的毒素-核酸适配体序列，并使其与相应荧光标记互补序列杂交，形成微球-适配体-互补链复合物，然后将其同时置于混合样品中进行两种毒素的检测。最终确定OTA、FB1这两种毒素的检测线性范围分别为:1-0.01ng/mL、1-0.001 ng/mL;线性方程分别为:y=1054.35+322.89x(R2=0.986)、y=1491.68+410.88x(R2=0.994)。然后在谷物中添加不同浓度的OTA、FB1进行回收率测定，回收率范围分别为:81.8±6.28％～116.38±7.60％、76.58±5.96％～122.32±2.89％。最后使用本实验方法对21份谷物样品进行了检测，同时用ELISA方法进行对照，两种方法结果经统计学分析显示无显著性差异(P＞0.05)。

目录

声明

摘要

缩写表

第1章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 赭曲霉毒素简介

1．1．2 伏马毒素简介

1．2 核酸适配体的概述

1．2．1 核酸适配体的定义

1．2．2 核酸适配体的筛选—SELEX技术

1．2．3 核酸适配体的优势及应用

1．3 光子晶体材料简介

1．3．1 光子晶体的定义及制备方法

1．3．2 光子晶体的光学编码方法及特点

1．4 真菌毒素的检测方法及目前研究进展

1．4．1 薄层色谱法

1．4．2 高效液相色谱法

1．4．3 酶联免疫吸附法

1．4．4 其它常用方法

1．4．5 目前研究进展

1．5 本课题研究的目的、意义及内容

1．5．1 本课题研究的目的和意义

1．5．2 本课题的研究内容

第二章 二氧化硅光子晶体微球(SPCMs)的制备及其功能化研究

2．1 SPCMs的制备

2．1．1 试验材料及仪器

2．1．2 水相与油相溶液的配置

2．1．3 SPCMs的制作和保存

2．2 SPCMs的表征

2．2．1 结果与讨论

2．3 SPCMs载体的表面功能化方法研究

2．3．1 实验材料及仪器

2．3．2 不同修饰方法对SPCMs载体荧光背景的影响

2．3．3 不同GPTMS浓度修饰的SPCMs杂交反应后的荧光信号的影响

2．3．4 实验结果与讨论

2．4 本章总结

第3章 基于核酸适配体技术检测农产品中赭曲霉毒素A

3．1 实验试剂与仪器

3．1．1 实验材料和试剂

3．1．2 核酸适配体序列

3．1．3 主要试剂的配制

3．1．4 主要实验仪器设备

3．2 OTA的定量检测方法

3．3 反应条件的优化

3．3．1 OTA-aptamer的浓度优化

3．3．2 荧光标记互补序列浓度优化

3．3．3 杂交条件的优化

3．3．4 OTA结合条件的优化

3．3．5 减小非特异性吸附的研究

3．4 谷物中赭曲霉毒素A的检测

3．4．1 标准曲线制作

3．4．2 特异性分析

3．4．3 回收率测定

3．5 实验结果与分析

3．5．1 OTA-核酸适配体的浓度优化

3．5．2 OTA-荧光标记互补序列浓度优化

3．5．3 杂交条件的优化

3．5．4 OTA结合条件的优化

3．5．5 减少非特异性吸附研究

3．5．6 标准曲线的制作

3．5．7 特异性分析

3．5．8 回收率测定

3．6 结果讨论

3．7 本章小结

第4章 农产品中真菌毒素的多重检测

4．1 试验材料及仪器

4．1．1 试验材料及试剂

4．1．2 核酸适配体序列

4．1．3 试验仪器

4．2 体系条件的优化

4．2．1 FB1-核酸适配体的浓度优化

4．2．2 FITC标记的互补序列浓度优化

4．2．3 杂交条件的优化

4．3 农产品中OTA与FB1的同时检测

4．3．1 标准曲线制作

4．3．2 多重特异性分析

4．3．3 回收率测定

4．3．4 ELISA方法比较

4．4 实验结果与分析

4．4．1 FB1-aptamer的浓度优化

4．4．2 FB1-荧光标记互补序列浓度优化

4．4．3 杂交条件的优化

4．4．4 多重标准曲线的制作

4．4．5 特异性分析

4．4．6 多重检测回收率测定

4．4．7 ELISA方法比较

4．5 结果讨论

4．6 本章小结

全文总结

论文创新点

展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢