一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的酶促酯交换制备方法

摘要

本发明公开了一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酸酯的酶促酯交换制备方法，属于油脂加工技术领域。本发明以猪油为原料，通过分离提取获得棕榈酸和油酸，利用褶皱假丝酵母脂肪酶催化棕榈酸和甘油合成棕榈酸甘油三酯，再利用固定化米根霉sn-1,3特异性脂肪酶催化棕榈酸甘油三酯和油酸合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酸酯。本发明所提供的方法，所用原料来源广泛，价格低廉，反应过程简单，并且产物含量较高，纯度可达到76.19％，适于产业化推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的酶促酯交换制备方法，属于油脂加工技 术领域。

技术背景

人乳中含有大概约4％-4.5％的脂肪，其中有98％为甘油三酯。人乳脂为婴儿提供50％左 右能量，同时也可为婴幼儿提供一些必需脂肪酸和长链的多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA 等，具有能够促进脂溶性的维生素的吸收等功能。

人乳中含有具有特殊脂肪酸组成和结构的甘油三酯，它能使婴儿更好地吸收矿物质和脂 肪。这不仅对婴儿的成长发育非常重要，而且还能显著降低婴儿便秘的可能性。天然人乳脂 肪具有自己独特的结构特点，在植物油和牛乳的脂肪中，饱和的脂肪酸主要分布在三甘酯的 甘油骨架的sn-1或sn-3位上，与人乳有一定差异。作为人乳替代品的婴幼儿配方奶粉，其脂 肪结构应尽量接近人乳，但现状并非如此。虽然婴儿配方奶粉能近似的替代人乳，但是，这 种对婴儿至关重要的特殊甘油三酯添加并没有被重视。

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)以其独特的结构优势作为一种新型人乳脂肪替代 品已经引起了大家的广泛注意。2008年中华人民共和国卫生部第13号公告批准了1,3-二油酸 -2-棕榈酸甘油三酯作为营养强化剂用于婴儿配方奶粉中。早在上个世纪末期，随着对婴儿营 养摄入需求的不断研究，对合成OPO等人乳脂肪替代脂肪的研究就逐渐的深入起来。

OPO作为一种新资源食品，大多是由脂肪酶催化酯交换反应，使脂肪酸在甘油分子上的 位置重新排列而得。酶催化具有反应条件温和、活性高和无污染等优点。相对于具有工艺复 杂和环境污染大等对工业化生产有限制性缺点的化学生产法，环境友好、反应条件温和的酶 法催化反应不断受到人们的青睐。由于游离酶回收难，不利于重复使用，限制了其规模化应 用。应用固定化脂肪酶的酶促酯交换法生成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯，避免了化学生产 造成的污染和浪费，提高了溶剂和原料的重复利用性，保护环境节省资金。

国外的研究人员主要是以富含棕榈酸的植物油脂如棕榈油等为原料，通过酯交换方法对 1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯进行合成。其中Jan Pfeffer和U Schmid等人将甘油三酯转化为 高纯度2-棕榈酸单甘酯，这个过程需要结晶纯化，配备较多的设备和大量有机溶剂，然后再 继续添加油酸合成高纯度的OPO。虽然合成产物中OPO纯度较高，但是增加了反应步骤， 需要对2-棕榈酸单甘酯进行纯化使其达到较高浓度才能保证最终产物OPO的纯度。在纯化分 离的过程中会造成溶剂等的浪费且过程较繁琐，既不利于环保又不利于大规模工业化生产。 国内的研究人员用棕榈酸酸甘油三酯(Tripalmitate,PPP)为底物合成OPO的比较少，多以动 物油脂为原料合成富含OPO的人乳脂肪替代品，合成的产物中OPO纯度在43％—74％不等。 因为棕榈油多产于热带，使用猪油等来源广泛的动物油脂对我国工业生产比较具有实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种产物含量高，反应过程简单，原料来源广泛且价格低廉易于获 取，更加适合工业化推广的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯合成方法。为解决上述技术问题， 本发明采取如下技术方案：

一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的酶促酯交换制备方法，是以猪油为原料，通过分离 提取获得棕榈酸和油酸，利用脂肪酶催化棕榈酸和甘油合成棕榈酸甘油三酯，再利用固定化 sn-1,3特异性脂肪酶催化棕榈酸甘油三酯和油酸合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酸酯。

所述方法的步骤如下：

1)棕榈酸和油酸的提取：以猪油为原料，先与碱和乙醇反应，在利用正己烷萃取获得脂 肪酸混合液，再利用丙酮溶解低温储存后分离棕榈酸，再用乙腈溶解低温储存后分离提取油 酸；

2)棕榈酸甘油三酯的合成：以脂肪酶为催化剂，催化步骤1)所得棕榈酸和甘油合成棕 榈酸甘油三酯；

3)1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的合成：以固定化sn-1,3特异性脂肪酶为催化剂催化步 骤1)所得油酸和步骤2)所得棕榈酸甘油三酯合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。

所述方法的步骤1)所述碱为氢氧化钾，所述乙醇的浓度为95％，反应温度60℃，反应 时间1h；

所述方法的步骤1)所述丙酮，添加比例为40ml/g脂肪酸混合液，添加温度为40℃，所 述低温为-18～-24℃，储存时间为24～30h。

所述方法的步骤1)所述乙腈，添加比例为60ml/g不饱和脂肪酸，所述低温为-18～-24℃， 储存时间为24～30h。

所述方法的步骤2)所述脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，所述合成棕榈甘油三酯，合成 条件为甘油与棕榈酸的比例为1:4，脂肪酶添加量8％，反应时间4h，反应温度60℃。

所述方法的步骤3)所述固定化sn-1,3特异性脂肪酶为米根霉sn-1,3特异性脂肪酶，所 述合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯，合成条件为油酸和棕榈酸甘油三酯的比例为4：1，固 定化米根霉sn-1,3特异性脂肪酶添加量7％，反应时间4h，反应温度60℃。

所述方法的具体步骤如下：

1)取1g猪油，加入到含有0.23gKOH，2.64ml95％乙醇和0.44ml水的混合体系中，在 60℃下水浴反应1h，在加入蒸馏水、正己烷，萃取获得水相，再用盐酸调节pH至1.0，再用 正己烷萃取，得到油相，经氮气吹除溶剂后，得到脂肪酸混合液；

2)将步骤1)所得的脂肪酸混合液与丙酮按40ml/g的比例在40℃下搅拌直到所有的脂 肪酸溶解，冷却至室温后，在-24℃下储存24h，储存后在-24℃下过滤得到固相棕榈酸，氮 吹液相后，得到不饱和脂肪酸；

3)按照60ml/g步骤2)所得的不饱和脂肪酸的比例添加乙腈溶解不饱和脂肪酸，再在 -24℃储存24h，储存后在-24℃下过滤氮吹，获得油酸；

4)将甘油和步骤2)所得棕榈酸以1：4的比例混合，添加8％的褶皱假丝酵母脂肪酶， 60℃下反应4h后用丙酮溶解，离心分离去除酶和固体，获得棕榈酸甘油三酯；

5)取步骤3)所得油酸和步骤4)所得棕榈酸甘油三酯，按4：1的比例混合，添加7％ 固定化米根霉sn-1,3特异性脂肪酶，60℃下反应4h后，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。 本发明的有益效果：

(1)原料来源广泛且价格低廉易于获取，反应过程简单，更加适合工业化推广。

在合成原料方面，合成OPO惯用的棕榈酸甘油三酯多产于热带，需要进口。与之相比， 猪油无需进口，来源广泛易于获取，便于就地取材。而且猪油作为动物油脂，用于工业加工 比直接食用更加环保健康。与先合成棕榈酸单甘酯的方法相比，本发明直接由棕榈酸甘油三 酯合成OPO，省略掉合成棕榈酸单甘酯的步骤。将甘油三酯转化为高纯度2-棕榈酸单甘酯， 这个过程需要结晶纯化，配备较多的设备和大量有机溶剂，然后再继续添加油酸合成高纯度 的OPO。虽然合成产物中OPO的含量较高，但是增加了反应步骤，需要对2-棕榈酸单甘酯 进行纯化使其达到较高浓度才能保证最终产物OPO的纯度。在纯化分离的过程中会造成溶剂 等的浪费且过程较繁琐，既不利于环保又不利于大规模工业化生产。

(2)产物含量较高，纯度可达到76.19％，目前市售产品的纯度一般在40％左右。本发明 与目前的制备方法相比，含量有大幅度提高。

国内的研究人员用棕榈酸酸甘油三酯为底物合成OPO的比较少，多以动物油脂为原料合 成富含OPO的人乳脂肪替代品，合成的产物中OPO纯度在43％—74％不等。本发明以猪油 为底物，选用固定化sn-l,3脂肪酶为催化剂合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。研究了反应 温度、反应时间、底物摩尔比及加酶量对产物中OPO含量的影响并利用响应面分析优化使 OPO的最高纯度达到76.19％。反应过程简单，原料来源广泛且价格低廉易于获取，更加适合 工业化推广。

附图说明

图1为棕榈酸甘油三酯样品液相检测图。

图2为1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯样品液相检测图。

图3为理化条件对OPO转化率的影响；

(a,反应时间对OPO转化率的影响；b，反应温度对OPO转化率的影响；c，底物比对OPO 转化率的影响；d，加酶量对OPO转化率的影响)。

图4为交互作用相应曲面图；

(a，反应时间与底物比交互作用；b，反应时间与加酶量交互作用；c，加酶量与底物比交互 作用；)。

具体实施方式

本发明提供的制备OPO的方法，具有原料来源广泛，价格低廉，反应过程简单，产物含 量高等特点，适于产业化推广。下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施 例的限制。

实施例1 脂肪酸的分离纯化

1.猪油中脂肪酸的提取

取1g猪油、0.23g KOH、2.64mL95％乙醇及0.44mL水，在60℃下水浴反应1h，再 加入蒸馏水、正己烷，萃取后得到水相。用盐酸调节pH至1.0，再用正己烷萃取，得到的油 相经氮吹除去溶剂，得到混合脂肪酸。

2.脂肪酸的分离

取上述得到的混合脂肪酸，与丙酮按每克40mL的比例在40℃条件下搅拌直到所有的 脂肪酸溶解。使该溶液冷却至室温，随后在-24℃储存24h。在-24℃条件下过滤，得到的固 相饱和脂肪酸主要成分为棕榈酸，作为下一步合成的原料之一。将过滤得到的液相进行氮吹， 得到不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸，留待进一步纯化以得到较高含量的油酸。

3.不饱和脂肪酸的纯化

将上述方法中分离得到的液相不饱和脂肪酸以每克60mL的比例继续溶解于乙腈中，在 -24℃储存24h。在-24℃条件下过滤后进行氮吹，继续提高油酸的含量比例。

实施例2 棕榈酸甘油三酯(PPP)的合成

选用褶皱假丝酵母脂肪酶(lipase from Candida rugosa)作为生物催化剂，催化实施例1 中分离出的棕榈酸和甘油合成棕榈酸甘油三酯。取甘油、分离出的棕榈酸和脂肪酶在1.5mL 离心管中进行反应。反应要求在60℃无溶剂下进行，反应时间为4h，甘油与棕榈酸的比例 为1:4，加酶量为反应底物的8％。得到的产物棕榈酸甘三酯作为下一步合成OPO的底物。反 应后得产物用丙酮溶解，离心分离去除酶和未反应的固体，取上清液稀释。反应结束后，取 0.1g样品溶于1mL正己烷中，进行薄板层析。刮取甘三酯条带，溶于1mL正己烷中，进行 液相检测，液相检测图谱见图1，结果显示：在反应温度为60℃，反应时间为4h，甘油与 棕榈酸的比例为1:4，加酶量为反应底物的8％条件下合成棕榈酸甘油三酯，产物经纯化后经 HPLC检测纯度在80％以上。

液相检测条件：Waters高效液相色谱仪；色谱柱：反相C18色谱柱；流动相：A相为丙 酮，B相为乙腈，A、B相体积比为8:2，等度洗脱；流速：1mL·min-1；检测仪：示差折光 检测器；色谱柱温：30℃；进样体积：10μL。

实施例3 1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的合成

取实施例2中合成的PPP，以及实施例1中分离纯化的油酸于1.5mL离心管内，加入sn-1,3 特异性脂肪酶。在无溶剂条件下，置于60℃水浴锅中反应4h。在反应过程中定期取样进行 液相检测。酸解反应完成后，通过离心分离去除反应产物中的脂肪酶，得到甘油三酯和脂肪 酸的混合物。通过薄层层析分离甘油三酯和游离脂肪酸后，刮取甘油酯条带，溶于1mL正己 烷中，进行液相检测，液相检测图谱见图2。结果显示：在反应温度为60℃，反应时间为4h， 底物摩尔比(OA/PPP)为4:1，加酶量为底物质量的7％条件下合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三 酯，合成的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯得率在40％以上，产物经HPLC检测，1,3-二油酸 -2-棕榈酸甘油三酯的纯度在70％以上。

液相检测条件：Waters高效液相色谱仪；色谱柱：反相C18色谱柱；流动相：A相为丙 酮，B相为乙腈，A、B相体积比为8:2，等度洗脱；流速：1mL·min-1；检测仪：示差折光 检测器；色谱柱温：30℃；进样体积：10μL。

实施例4 理化条件对OPO合成的影响

由于不同的理化条件对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的合成产量及纯度都有一定的影 响。因此，用单因素实验分析反应时间(h)、反应温度(℃)、底物摩尔比(OA/PPP)和加酶量(％) 等对产物中OPO含量的影响。

1.反应时间对OPO转化率的影响

在60℃，一定底物摩尔比和酶添加量条件下，考察反应时间10h内反应产率的变化。 因为在无水体系中，从反应开始阶段，固定化脂肪酶就表现出较高的活性，结果如图3a所示。

从图3a可知，反应4h之前呈较快的上升趋势，OPO的纯度提高了接近10％，说明在 这段时间内固定化酶的催化活性较高；5h之后OPO的纯度呈逐渐下降的趋势，到10h的时 候反应物中OPO的纯度由最高的74.77％下降至67.08％。这可能是由于反应中生成的水分 含量达到了一定的值后开始影响反应酶的催化活性。

2.反应温度对OPO转化率的影响

通常情况下，每当温度增高10℃，反应速度约增大1倍。但是当达到某一温度时，继续 升高温度会导致酶的活性逐渐下降并失活，因为此时反应体系中的能量足够破坏酶分子的蛋 白结构。因此，选择适合酶活性的反应温度对反应的良好进行非常重要。

在反应时间4h，考察不同反应温度(30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)对OPO纯度的 影响。由图3b可知在反应温度从30℃逐渐升高达到60℃的时候，产物中OPO纯度由65.47％ 上升到74.88％，OPO纯度与温度呈正相关。但是当温度高于60℃时，可能反应体系中的能 量足以破坏酶分子的蛋白结构，固定化酶开始逐渐失去活性。从60℃上升至70℃的时候， OPO的纯度降至66.61％。

3.底物摩尔比对OPO转化率的影响

在反应体系中，底物的配比对产物的产量和转化率是有一定影响的，因为底物的比例在 一定程度上决定了反应到达平衡的时间以及反应到达平衡时产物的转化水平。正确的配比可 以避免原料的浪费，也可避免反应中副反应的发生，减少反应抑制。因此，确定适当的摩尔 比是十分必要的。当反应温度为60℃、一定的酶添加量和反应时间(4h)条件下，考察不同的 底物摩尔比(OA/PPP)(2:1、4:1、6:1、8:1和10:1)对反应产率的影响。

本发明考察了不同底物摩尔比对OPO产率的影响，结果如图3c所示。由图3c可知，底 物摩尔比由2:1上升到4:1的时候，产物中OPO的纯度显著上升，由65.84％上升至74.83％， 上升趋势非常明显。但当底物摩尔比大于4:1之后，随着油酸比例的增大，OPO的纯度逐渐 降低。说明过多的油酸影响了的酯化水平，也有可能发生了一些副反应或反应抑制，同时也 是对原料的一种浪费。

4.加酶量对OPO转化率的影响

在酶催化反应过程中，当底物浓度较大时，酶与底物充分反应，反应速度与加酶量成正 比，酶与底物结合反应的概率与加酶量呈正相关，加酶量越大，反应速度越快，转化率越高； 但当加酶量占底物总量的比例过大时，反而会影响酶与底物的结合反应，酶的催化效率降低， 转化率也受到一定影响。因此对于酶促反应选择适合的给酶量十分必要。在60℃，一定底物 摩尔比和反应时间(4h)条件下，考察不同的加酶量(3％、5％、7％、9％和11％)对反应产率 的影响。

本发明考察了不同加酶量对OPO产率的影响，结果如图3d所示。由图3d可知，当加酶 量在底物重的7％以下时，OPO纯度随加酶量的升高呈线性升高趋势，这时底物的浓度足够 大，转化率与加酶量成正比。但当酶含量超过7％以上，OPO的纯度随着酶含量增高而下降， 从7％时的73.23％下降到了66.77％(酶含量为11％时)，此时酶量过大，由于底物量不足， 会导致酶的催化效率降低。所以OPO的纯度下降。

实施例5 响应面优化

在确定了每个单因素的最优值后，应用响应面法优化出合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三 酯的最佳反应条件。取每个因素最佳值为0点，以0点为中心左右各取一个值，形成四水平 三因素的响应面模型进行分析。

在单因素实验确定OPO含量的最适反应温度、反应时间、底物摩尔比和加酶量的基础上， 根据Box-Behnken实验设计原理，以反应温度、反应时间、底物摩尔比和加酶量为自变量， OPO纯度为响应值(Y)，设计响应面分析实验，表1为实验因素设计，实验结果见表2。

表1 OPO含量实验因素水平编码表

表2 Box-Behnken实验设计及响应值

利用Design Expert软件，通过表2中的实验数据获得OPO纯度(Y)对自变量反应时间 (A)、反应温度(B)、底物摩尔比(C)和加酶量(D)的二次多项回归方程：

Y＝75.33+1.49A-1.92B+0.99C+1.70D-0.24AB-0.080AC+0.088AD-14BC+8.062E-003BD-0.1 2CD-3.04A2-3.38B2-2.12C2-2.75D2。

由表3可以看出，本研究所选用的模型极显著(P＜0.0001)，方程的失拟项不显著(P>0.05)， 相关系数R²＝0.9889，说明各因素值和响应值之间的关系可以用此模型来函数化。

表3 回归方程方差分析及显著性检验

注：*P<0.0500显著，**P<0.0100极显著。

从4个因素对产物中OPO纯度的影响来看，回归方程的一次项反应时间(A)、反应温度 (B)、底物摩尔比(C)和加酶量(D)对OPO纯度的线性效应影响都显著；二次项A²、B²、C²和 D²均对OPO纯度曲面效应极显著；两因素之间的交互作用都不显著，图4a-c为部分交互作 用的响应曲面图。

反应时间与底物摩尔比对OPO纯度的影响见图4a，由图可知：响应面的坡度在反应时 间一侧相对陡峭，而在底物摩尔比一侧较为平缓，表明OPO纯度对反应时间与底物摩尔比的 交互作用不敏感，当反应时间在4-5h时最高。二者交互作用不显著。

反应时间与加酶量对OPO纯度的影响见图4b，由图可知：响应面的坡度在反应时间一 侧较为陡峭，而在加酶量一侧较为平缓，表明OPO纯度对反应时间与加酶量的交互作用不敏 感，当反应时间在4-5h时最高。二者交互作用不显著。

底物摩尔比与加酶量对OPO纯度的影响见图4c，由图可知：响应面的坡度在底物摩尔 比一侧较为陡峭，而在加酶量一侧较为平缓，表明OPO纯度对反应时间与加酶量的交互作用 不敏感，当底物摩尔比在4:1—5:1时最高。二者交互作用不显著。

应用Design Expert对回归方程进行优化，优化后经验证结果为：反应温度为57℃、反 应时间为4.5h、底物摩尔比(OA/PPP)为4.5:1和加酶量为7.62％，此时产物中OPO的得率 为53.3％，产物中OPO纯度为76.19％。