pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As重组质粒构建及其转染Bcap-37细胞后细胞凋亡的研究

摘要

目的构建人反义Hsp70重组质粒[pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As]并观察其对乳腺癌Bcap-37细胞凋亡特性的影响.方法依照人hsp70mRNA全长序列,通过计算机分析,设计一对引物,在上游引物中带有1个BamHⅠ位点,经RT-PCR扩增、电泳、回收和纯化hsp70144-517片段,通过T-A克隆到pGEM-TEasy原核表达质粒中,经DNA测序和EcoRⅠ酶切图谱鉴定;EcoRⅠ酶切产物回收后亚克隆到pcDNA3.1(+)质粒中EcoRⅠ位点之间,利用BamH Ⅰ酶切图谱筛选反向插入重组质粒,经DNA测序得到pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As重组质粒.以脂质体介导法将pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As转染到乳腺癌Bcap-37细胞中并克隆培养建株得到AsHsp-Bcap细胞.以DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞周期分析观察转染细胞的凋亡特性.结果本研究成功构建人反义hsp70重组质粒[pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As];转染到乳腺癌Bcap-37细胞后在DNA琼脂糖凝胶电泳上观察到细胞凋亡特征性DNA Ladder及流式细胞周期分析发现G1峰前有1个特征性Ap峰(亚二倍体峰).结论构建人反义重组质粒pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As对乳腺癌Bcap-37细胞有促进细胞凋亡的作用.