一步法微滴数字PCR检测生菜中GⅡ型诺如病毒

摘要

目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GⅡ型诺如病毒(norovirus genegroupⅡ,NoV GⅡ)的方法.方法:优化RT-ddPCR检测NoV GⅡ的反应体系;通过10倍梯度稀释的NoV GⅡ线性阳性质粒确定RT-ddPCR的检测范围;利用其他常见的肠道病毒核酸(非GⅡ型诺如病毒)作为反应模板,与NoV GⅡ核酸同时进行RT-ddPCR,判定反应体系的特异性,并通过不同时间多次检测样品的方式判断该检测方法的稳定性.采用ISO/TS 15216-1:2013食品中诺如病毒RNA提取方法,对人工染毒不同水平(高、中、低)的NoV GⅡ生菜样品进行检测,同时研究去除抑制物前后对RT-ddPCR检测的影响,并与逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行检测回收率的对比,探究RT-ddPCR在食品中NoV GⅡ快速与定量检测上的发展潜力与应用前景.结果:RT-ddPCR的最高检测限为8.47×104 copies/μL,最低检测限为2.12 copies/μL,RT-ddPCR扩增效率为95.44％,标准曲线相关系数为0.997 3.在不同浓度人工染毒生菜样品中,抑制物的存在对ddPCR回收率检测结果没有显著性差异.在高、中染毒浓度下,抑制物对RT-qPCR与RT-ddPCR回收率检测结果影响不显著.低浓度下,未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率仅1.43％,与去除抑制物后的RT-qPCR检测结果(平均回收率为9.71％)有显著差异,且与RT-ddPCR的检测结果(未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率为11.80％,去除抑制物后平均回收率为12.53％)存在显著性差异.结论:生菜抑制物对RT-ddPCR的检测影响不显著,利用RT-ddPCR可有效测出低浓度的受污染样品,避免用现有的RT-qPCR方法因抑制物带来的“假阴性”检测结果.本实验建立的RT-ddPCR方法能高效、灵敏地检测出受污染食品中NoV GⅡ的低病毒含量,在食源性病毒检测中具有可观的发展潜力和应用前景.