植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定

摘要

以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 kDa,理论等电点为5.15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白.Ser、Thr、Tyr磷酸化位点个数分别为3、3、7.蛋白质的二级结构主要构成方式为α螺旋、无规则卷曲和β折叠.将此基因连接到pET-28a(+)质粒载体中构建重组质粒pET28a-DH,并转化入大肠杆菌E.coli Transetta(DE3)中获得重组大肠杆菌.重组菌在16℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导16h有可溶性表达,经Western Blot验证确定为重组羟基脂肪酸脱氢酶.通过镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶.重组酶经初步活性检测,结果显示重组酶可以转化10-羟基-顺-12-十八碳烯酸为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,本研究为进一步探明植物乳杆菌P-8转化共轭亚油酸的机制奠定了基础.