β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

摘要

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,p-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体pET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 kDa左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质.结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适pH为7.0,并且在pH为5.5～10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5h时仍保持90％以上的活性.研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca2对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用.对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/mL,vmax为0.33 mg/(min·mL).该研究成功实现了p-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础.