高糖土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶基因克隆表达及酶学性质分析

摘要

[目的]通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据.[方法]提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质.[结果]成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A.该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73％;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的Km值为6.45 mM,Vmax为50μmol/(mg·min).在15 ～50℃热处理1h后仍保留90％以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活.[结论]宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础.