嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

摘要

到目前为止，已有上百个微生物β-葡萄糖苷酶基因得到克隆，许多微生物来源的β-葡萄糖苷酶基因已获得异源表达。真菌中目前研究得较多的是酵母和木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus')等霉菌。嗜热真菌研究较少，目前仅在Humicola grisea，Talaromyces emersonii和Thermoascus aurantiacus(原种)中报道过。由于嗜热真菌表达的热稳定性β-葡萄糖苷酶在高温环境中的稳定性和高活力，因此具有比常温菌β-葡萄糖苷酶无法比拟的应用优势。 嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)是一种分布广泛、生长上限温度很高的真菌，该菌在乳糖为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生β-葡萄糖苷酶，应用分子生物学手段，将热稳定β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中高效表达，使β-葡萄糖苷酶在常温和短时间内快速、超量表达，以达到降低能耗和提高经济效益的目的，从而为工业应用奠定基础。 从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl I和bgl II的全长序列。Genbank登录号分别为EU269025和EU263993，将各片段分别插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K/bgl I和pPIC9K/bgl II，经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中，在醇氧化酶AOX1基因启动子作用下，分别获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株。经DEAE-Sepharose阴离子层析分别纯化了重组表达蛋白，SDS-PAGE分别测得该重组蛋白分子量约为120 kDa和118 kDa。经甲醇诱导，工程菌株发酵液中β-葡萄糖苷酶的活力分别为1.2 U/mg和0.23 U/mg，小规模发酵量都达0.45 mg/mL。前者β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为5.5。70℃保温30分钟仍保持80％的酶活力，具有较高的热稳定性，在pH3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强。后者β-葡萄糖苷酶酶的最适反应pH为5.0，最适反应温度为50℃，热稳定性比前者差。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词及中文对照表

声明

第一节文献综述

引言

1β-葡萄糖苷酶的研究进展

1.1β-葡萄糖苷酶的生态分布

1.2β-葡萄糖苷酶的分子结构

1.3β-葡萄糖苷酶的分类

1.4信号肽序列

1.5β-葡萄糖苷酶的活性中心结构

1.6β-葡萄糖苷酶催化反应机制

1.7β-葡萄糖苷酶的底物专一性

1.8β-葡萄糖苷酶活性测定

1.9β-葡萄糖苷酶的相对分子量

1.10β-葡萄糖苷酶的最适pH、pH值稳定性及pI

1.11β-葡萄糖苷酶的最适温度及热稳定性

1.12β-葡萄糖苷酶的抑制剂和金属离子

1.13β-葡萄糖苷酶的基因克隆及表达

2β-葡萄糖苷酶的应用及前景展望

2.1β-葡萄糖苷酶在肿瘤诊断和治疗方面的应用

2.2生产低聚龙胆糖

2.3水解纤维素

2.4作为风味酶

2.5其它应用

3本研究的目的和内容

3.1研究目的和意义

3.2研究内容

3.3技术路线

第二节嗜热子囊菌光孢变种热稳定β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶基因的cDNA克隆

1.3嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶基因DNA的克隆及序列分析

2结果与分析

2.1嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取

2.2嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶基因cDNA的克隆

3讨论

3.1小结

3.2基因分离技术

3.3后续工作的展望

第三节嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达

1材料和方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 Thermoascus aurantiacus var.levisporusβ-葡萄糖苷酶成熟肽基因序列的分离

2.2 Thermoascus aurantiacus vat.levisporusβ-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达

3讨论

3.1小结

3.2表达重组β-葡萄糖苷酶的Pichia pastoris表达系统评析

第四节结论和展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表论文