环糊精糖基转移酶和羰基还原酶基因表达及酶学性质研究

摘要

由于传统化学工业对环境的污染越来越引起人们的重视，生物催化（酶催化和全细胞催化）越来越多的应用于化合物的工业生产。
　　环糊精葡萄糖基转移酶（CyclodextrinGlycosyltransferase/Glucanotransferase）简称为CGTase，(E.C.2.4.1.19)属于α淀粉酶家族，能够催化直链淀粉生成环糊精(Cyclodextrin，CD)。β-CD有非常优越的理化性质和包结行为，可以更好将许多物质包裹起来从而改变物质的溶解度、挥发性等理化性质，因此β-CD的开发引人注目。近年来CGTase已经引起人们越来越高的重视，成为了人们研究的热点。
　　建立了一个快速筛选产CGTse菌株的方法，通过酚酞作指示剂，以淀粉为唯一碳源富集培养，通过透明圈大小进行菌株的筛选。从特定的100个土壤样品中筛得18株产CGTase的菌株，对其中的一株进行了详细研究。对野生菌的生长状况作了研究，在25h左右达到稳定期，通过对菌的形态观察:在固体培养基上生长时菌落成不规则圆形，培养5天，菌落直径在2cm左右。淡黄色，表面光滑，黄色。通过显微镜观察，菌体形态为短杆状，革兰氏染色后呈红色，因此为革兰氏阴性菌、16SrDNA序列扩增:通过对菌株V2-1的16SrDNA进行比对，其与芽孢杆菌Bacillussp.同源性很高，达到99％，以及进化树绘制对菌进行鉴定，确定野生菌属于芽孢杆菌属（Bacillussp.）。
　　从NCBI数据库中搜集相关序列信息，设计简并引物，后根据扩增序列结果再设计引物，最终从筛选菌株中成功克隆得到目的基因，基因共2172bp，编码724个氨基酸。N端包含一个信号肽，根据预测结果及实验验证，信号肽约为48个氨基酸。目的蛋白在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中成功表达，诱导温度为25℃，时间为80h，蛋白为胞外蛋白，不含信号肽。发酵液浓缩后SDS-PAGE验证并进行酶活测定，发酵液中酶活达到1U/mL。通过Q-Sepharose离子交换柱和phenyl-Sepharose疏水柱，对目的蛋白进行了纯化，最终得到较纯的目的蛋白。
　　手性醇是合成一些有高附加值化学品的基石，最直接得到手性醇的方法是化学法和生物催化法还原前手性的酮类。生物法作为一种化学方法的补充已经用于一些手性醇的生产，羰基还原酶就可以催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。
　　毕赤酵母GS115基因组已经得以测序，本文通过对毕赤酵母GS115基因组序列分析同时与已知的羰基还原酶的蛋白序列比对，在2号染色体上发现了一个可能的羰基还原酶基因ppcr(GeneBankAccessionNO.XM_002491410)。成功克隆目的基因并在EcoliBL21(DE3)中表达，Ni-NTA纯化，对酶的性质和底物谱进行了研究。
　　基因长度为759bp，在C端有his标签，以便于纯化。PPCR的最适反应温度为35℃，最适反应pH为6.0，低于45℃时有很好的稳定性。对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48mmol/L和0.12s-1。PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性（ee值），对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性，在测定的底物中，除极少数底物外，ee值均达到97％以上。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 生物催化概述

1．1．1 生物催化定义及优点

1．2 环糊精

1．2．1 环糊精的分类及现状

1．2．2 环糊精的结构及性质

1．2．3 环糊精的应用

1．3 环糊精糖基转移酶

1．3．1 环糊精糖基转移酶功能及其作用机理

1．3．2 微生物中的CGTase

1．3．3 CGTase的应用

1．4 羰基还原酶

1．4．1 羰基还原酶及其分类

1．4．2 羰基还原酶的应用

1．5 本论文的目的、意义和主要内容

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 本课题的主要研究内容

2 材料和方法

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 土壤样品及质粒

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 实验中用到的培养基

2．1．5 试验中用的存储液的配制

2．1．6 感受态的制备

2．2 实验方法

2．2．1 产CGTase菌株的筛选

2．2．2 菌种的保藏

2．2．3 菌种鉴定

2．2．4 粗酶液的制备

2．2．5 酶活测定

2．2．6 V2-1生长曲线的测定

2．2．7 基因克隆

2．2．8 工程菌构建

2．2．9 目的蛋白表达

2．2．10 蛋白纯化

2．3 羰基还原酶目的基因的分析及克隆

2．3．1 目的基因序列的获取

2．3．2 目的基因的克隆

2．3．3 目的基因的表达

2．3．4 蛋白纯化

2．3．5 酶学性质测定

2．3．6 底物谱的测定

3 结果与讨论

3．1 环糊精糖基转移酶菌株的筛选及野生菌的初步研究

3．1．1 菌种筛选及酶活测定

3．1．2 菌株V2-1的形态学分析

3．1．3 菌种V2-1生长催化特性研究

3．2 目的基因(cgtV2-1)的克隆、表达及纯化

3．2．1 基因cgtV2-1的克隆

3．2．2 工程菌的构建

3．2．3 目的蛋白的表达

3．2．4 酶活测定

3．2．5 N端信号肽的初步研究

3．3 目的蛋白的纯化

3．3．1 Ni-NTA纯化

3．3．2 其它层析柱纯化

3．4 羰基还原酶PPCR的克隆、表达与纯化

3．4．1 目的基因ppcr的克隆

3．4．2 目的蛋白PPCR的表达和纯化

3．5 PPCR的酶学性质测定

3．5．1 分子量测定

3．5．2 最适pH的测定

3．5．3 最适反应温度及温度稳定性的研究

3．5．4 动力学参数的测定

3．6 PPCR的底物谱的测定

3．6．1 PPCR对醛的活性

3．6．2 PPCR对α-酮酯的活性

3．6．3 PPCR对β-酮酯的活性

3．6．4 PPCR对芳香酮的活性

4 结论

5 展望

参考文献

7 论文发表情况

致谢

9 附录