红杜仲不同乙醇浓度提取物对HaCaT细胞抗氧化作用的比较及其抗氧化机制的研究

摘要

目的 本研究对红杜仲不同乙醇浓度提取物抑制H2O2诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤作用进行筛选.方法 以不同浓度乙醇进行回流提取分别获得了30％、50％、70％及95％乙醇提取的四种红杜仲醇提取物(Parabarium micranthum ethanol extract,PEE),利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)法测定其体外清除自由基的能力.以人永生化表皮细胞HaCaT为研究对象,通过不同浓度H2O2处理细胞并筛选以200μmol/L作为建立H2O2诱导的氧化应激损伤模型的最适浓度.设立对照组、H2O2损伤组和红杜仲-H2O2组.通过微板法和比色法测定内源性抗氧化酶活力及细胞存活率,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针检测细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平,逆转录PCR测定Nrf2 mRNA表达量.结果 不同乙醇浓度提取的PEE在体外均具有清除DPPH自由基的作用,效果最强的70％乙醇提取的PEE的IC5o为7.6 mg/L;在细胞水平上,H2O2诱导使得HaCaT细胞内抗氧化酶SOD及CAT活力降低,50％、70％及95％乙醇提取的PEE能够显著提高细胞内抗氧化酶活力.其中70％乙醇提取的PEE的作用最为显著,抗氧化酶活力的提高表现出剂量依赖性,并且能显著提高细胞存活率、降低细胞内ROS的水平(与氧化应激组比,P ＜0.05或P＜0.01).同时,70％乙醇提取的PEE能够显著诱导抗氧化相关信号通路基因Nrf2 mRNA的表达.结论 70％乙醇提取的PEE可能通过激活Nrf2抗氧化信号通路,提高抗氧化酶活性,降低ROS水平,从而具有保护HaCaT细胞免受H2O2诱导的氧化损伤作用.