玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的条件优化

摘要

目的 通过优化玻璃珠破碎法的条件,制备最具活性的重组人CYP2C9酵母微粒体,从而为建立更加灵敏快捷的体外代谢筛选模型提供依据.方法 利用玻璃珠破碎的方法,制备重组人CYP2C9酵母微粒体.通过改变涡旋振荡次数和玻璃珠用量,优化制备微粒体的条件.用Lowry法测定微粒体中的蛋白含量,用CYP2C9的典型底物双氯芬酸与微粒体进行反应,以单位时间(h)内单位蛋白(mg/ml)所对应的双氯芬酸代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量来确定微粒体的蛋白活性.结果 随着涡旋振荡次数和玻璃珠用量的增加,所制备微粒体蛋白的含量增加.当涡旋振荡次数为30次(每次涡旋振荡30 s,冷却60 s),玻璃珠用量为0.75 g时,代谢物生成量和单位时间单位蛋白所对应代谢物生成量最大,分别为1.21μg和0.06μg/[(mg/ml)·h].结论 玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的最佳条件为涡旋振荡30次(每次涡旋振荡30 s,冷却60 s)和0.75 g玻璃珠.