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甘油替代葡萄糖发酵生产富马酸的代谢组学研究

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摘要

第一章 绪论

1.1 富马酸

1.1.1 物理性质与化学性质

1.1.2 应用前景

1.1.3 生产方法

1.2 发酵法生产富马酸的研究进展

1.2.1 发酵生产富马酸的菌种

1.2.2 生产富马酸的代谢途径

1.2.3 发酵法的原料

1.3 代谢组学简介

1.4 代谢组学的应用

1.4.1 代谢组学用于菌种鉴定

1.4.2 代谢组学用于发酵过程的调控

1.5 代谢组学的研究方法

1.5.1 样品制备

1.5.2 检测平台

1.5.3 数据处理方法

1.6 本课题研究内容和意义

1.6.1 课题研究思路

1.6.2 课题研究内容

1.6.3 课题研究意义

第二章 少根根霉(R.arrihizus)纯化复壮

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种

2.2.2 培养基

2.2.3 培养方法

2.2.4 分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 原始菌发酵生产富马酸情况

2.3.2 菌种的分离

2.3.3 初筛

2.3.4 复筛

2.3.5 RH 7-13-24#菌株的稳定性

2.4 本章小结

第三章 少根根霉(R.arrihizus)利用甘油和葡萄糖混合发酵生产富马酸

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 培养方法

3.2.4 分析方法

3.2.5 细胞膜脂肪酸的提取

3.3 结果与讨论

3.3.1 甘油添加比例优化

3.3.2 甘油添加时间优化

3.3.3 接种量的优化

3.3.4 种龄的优化

3.3.5 混合发酵对细胞膜通透性的影响

3.3.6 混合发酵对细胞膜脂肪酸的影响

3.4 本章小结

第四章 代谢组学分析方法的建立

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 培养基

4.2.3 培养方法

4.2.4 分析方法

4.2.5 细胞淬灭方法

4.2.6 细胞破碎方法

4.2.7 代谢物提取方法

4.2.8 衍生化方法

4.2.9 代谢物定性和定量分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 胞内代谢物提取及检测方法初试

4.3.2 不同淬灭条件的影响

4.3.3 不同提取剂的影响

4.4.4 不同细胞破碎条件的影响

4.4 本章小结

第五章 不同碳源对少根根霉(R.arrihizus)代谢轮廓的影响

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种

5.2.2 培养基

5.2.3 培养方法

5.2.4 分析方法

5.2.5 代谢物定性和定量分析

5.2.6 数据处理

5.3 结果与讨论

5.3.1 不同碳源对细胞内代谢物的影响

5.3.2 碳源含量对细胞内胞内代谢物的影响

5.3.3 混合发酵对细胞内胞内代谢物的影响

5.3.4 外源添加差异代谢物

5.4 本章小结

第六章 研究结论与建议

6.1 研究结论

6.2 建议

参考文献

附录

致谢

研究成果与发表的学术论文

作者及导师简介

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摘要

富马酸是一种高附加值的四碳二元羧酸化合物,广泛应用于化工、医药、食品等各行各业。本论文以实验室保存的少根根霉RH7-13#为出发菌株,利用溴甲酚绿作为指示剂进行菌种的分离纯化,大大的缩短了筛菌周期,并成功得到少根根霉RH7-13-24#菌。该菌与出发菌株相比,富马酸产量提高了49.01%,经过多次传代后高产富马酸性状稳定。
  本论文尝试使用甘油和葡萄糖进行混合发酵,经过一系列的优化后得到了最佳的发酵工艺条件:甘油的添加量为40 g/L,添加时间为发酵阶段24 h,接种量为30%(V/V)、种龄为24 h或者接种量为20%(V/V)、种龄为36h。此时富马酸的最高产量为24.87 g/L,与单纯发酵40g/L葡萄糖相比,富马酸产量提高55.63%;与单纯发酵40 g/L甘油相比,富马酸产量提高2437.75%;与单纯发酵80 g/L葡萄糖发酵相比,有效降低无氧呼吸副产物乳酸45.97%,降低副产物乙醇60.15%。通过对不同培养条件下的少根根霉RH7-13-24#细胞膜的通透性研究,以相对电导率为参考指标,发现混合发酵时细胞膜的通透性是单纯利用葡萄糖时的1.17倍,有利于细胞内外小分子物质的自由扩散。通过对不同条件培养后的少根根霉RH7-13-24#细胞膜的成分进行研究,发现甘油的加入会明显提高细胞膜上不饱和脂肪酸的含量,进而提高了细胞膜的流动性,有利于细胞在发酵液中更好的传质传氧,无氧呼吸减弱,副产物乙醇和乳酸的量降低。
  本论文尝试引入代谢组学的分析手段,尝试研究混合发酵对细胞内代谢轮廓的影响。首先经过优化淬灭条件、提取条件和检测条件等,建立了适合少根根霉细胞内小分子代谢物的提取方法,该方法下可以获得160余种细胞内小分子生物活性物质。然后经过相关统计学分析发现,少根根霉RH7-13-24#利用利用甘油为碳源时,细胞内的氨基酸类物质含量较高,主要用于满足细胞自身的生长需求;利用葡萄糖时细胞内EMP途径和TCA循环进行的强度较强,可以为富马酸的生产提供足够的ATP,因此混合发酵时,富马酸产量较高。混合发酵与单纯用葡萄糖发酵相比,细胞内丙氨酸、乳酸的含量不足,通过在发酵初始阶段直接添加0.4 g/L的丙氨酸,富马酸产量提高了9.3%;添加0.4 g/L乳酸,富马酸产量提高了8.4%。

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