一株高产胞外多糖红曲霉发酵和提取工艺及抗氧化活性研究

摘要

红曲霉（Monascus）是一类小型丝状腐生真菌，属子囊菌亚门、不整囊菌纲、散囊菌目、红曲科，其次级代谢产物富含色素、γ-氨基丁酸、莫纳卡琳、多糖等多种活性成分。国内外研究表明红曲多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学功能。目前对红曲霉液态发酵多糖的研究还比较少，本文从采集的红曲米和红腐乳中筛选出一株高产胞外多糖的红曲霉菌株Mr-70;研究了红曲霉菌株Mr-70产胞外多糖的液态发酵条件，优化了发酵培养基组成;利用响应面法(Response SurfaceMethod，RSM)优化了红曲霉菌株Mr-70胞外多糖的提取工艺;通过碱液浸提法对红曲霉菌株Mr-70的菌丝体多糖进行提取工艺优化;对红曲霉菌株Mr-70的胞外多糖和菌丝体多糖的体外抗氧化活性进行了初步研究。研究结果如下:
　　 (1)从浙江省各地采集来的红曲米和市售红腐乳中分离纯化得到256株红曲霉菌株，通过摇瓶发酵试验筛选获得了一株高产胞外多糖红曲霉菌株，经形态特征、生理生化特征和ITS序列分析将其鉴定为红色红曲霉菌株Mr-70(Monascus rubber)，命名为Mr-70，其胞外多糖产量达5.35 g/l。
　　 (2)为了提高胞外多糖的产量，对筛选得到的高产菌株Mr-70液态发酵条件进行了初步研究，得到红曲霉菌株Mr-70优化后的发酵工艺条件为:葡萄糖60g/l，蛋白胨20 g/l，K2HPO410 g/l，MgSO4·7H2O1.1 g/l，发酵液起始pH6.5，在摇床转速200 r/min，温度32℃的条件下培养96 h，胞外粗多糖产量可达10.15 g/l。
　　 (3)为了进一步提高红曲霉菌株Mr-70胞外多糖的提取率，选择影响胞外多糖提取的三个因素（乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH值）进行研究，并在单因素实验基础上，设计三因素三水平的Box-Behnken中心组合实验及响应面法分析对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖的提取工艺进行优化，建立了二次多项式回归方程的预测模型，得到红曲霉菌株Mr-70胞外多糖的最优提取工艺:乙醇沉淀时间为16.5h，乙醇体积分数为80％，发酵滤液pH值为8.05。
　　 (4)为优化红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖的碱提取工艺，在单因素试验的基础上，选择提取温度、碱液浓度、液料比以及浸提时间为自变量，多糖提取率为响应值，采用响应曲面法设计实验、分析研究各自变量及其交互作用对多糖提取率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖碱提取工艺的最佳条件为浸提温度49℃，碱液浓度7％，液料比23 ml/g，浸提时间2.3h。在此条件下，红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖提取得率达到10.1％。
　　 (5)探讨了红曲霉菌株Mr-70胞外多糖(EPS)、热水浸提的菌丝体多糖(HMP)和碱液浸提的菌丝体多糖(AMP)的体外抗氧化活性。从清除超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(OH·)、二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)三个方面，研究了EPS、HMP和AMP的体外抗氧化效果。结果表明，三种红曲霉多糖对DPPH自由基、O2-·和OH·均有一定的清除作用，且清除率与多糖浓度呈现出一定的量效关系;胞外多糖对三种自由基的清除能力明显强于菌丝体多糖;HMP和AMP在选定的浓度范围内对三种自由基的清除能力相近。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 红曲霉多糖的结构和理化性质

2 红曲霉胞外多糖的液体发酵及提取研究

3 红曲霉丝体多糖的提取

4 红曲霉多糖生物学活性的研究

4．1 抗氧化活性

4．2 抗肿瘤作用

4．3 提高免疫力作用

5 真菌多糖的应用

5．1 在医药领域的应用

5．2 在食品领域的应用

6 红曲霉的生物活性物质

6．1 红曲色素

6．2 γ-氨基丁酸(GABA)

6．3 莫纳可林K

7 立题背景和主要研究内容

7．1 立题背景

7．2 主要研究内容

7．3 技术路线

第二章 红曲霉胞外多糖高产菌株的筛选与鉴定

1 材料与仪器

1．1 菌株来源

1．2 培养基

1．3 药品及仪器

2 实验方法

2．1 红曲霉菌株的分离与保藏

2．2 菌种活化传代和发酵种子的培养

2．3 液体发酵培养和产多糖菌株的初筛

2．4 发酵液中多糖含量的测定

2．5 红曲霉菌株的鉴定

3 结果与分析

3．1 红曲霉菌株的分离纯化

3．2 高产胞外多糖红曲霉菌株Mr-70菌株的筛选

3．3 高产胞外多糖红曲霉菌株的鉴定

4 讨论

第三章 高产胞外多糖红曲霉菌株Mr-70液态发酵条件研究

1 材料

1．1 菌种

1．2 培养基

1．3 仪器与药品

2 实验方法

2．1 菌种的活化

2．2 种子液的制备

2．3 液体发酵培养

2．4 发酵液中多糖含量的测定

3 结果与分析

3．1 碳源对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．2 氮源对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．3 碳氮比对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．4 无机盐浓度对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．5 培养基起始pH值对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．6 摇床转速对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

3．7 摇瓶温度对红曲霉菌株Mr-70胞外多糖产量的影响

4 讨论

第四章 响应面法优化红曲霉菌株Mr-70胞外多糖提取工艺

1 材料

1．1 菌种

1．2 培养基

1．3 仪器与药品

1．4 设计分析软件

2 实验方法

2．1 种子液的制备

2．2 发酵培养

2．3 红曲霉菌株Mr-70胞外多糖的提取测定方法

2．4 红曲霉菌株Mr-70胞外多糖提取的单因素实验

2．5 响应面法设计和预测结果

3 结果与分析

3．1 单因素实验结果与分析

3．2 红曲霉菌株Mr-70胞外多糖提取条件的响应面法优化

4 讨论

第五章 红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖的碱提取工艺研究

1 材料

1．1 菌种

1．2 培养基

1．3 仪器与药品

1．4 设计分析软件

2 实验方法

2．1 技术路线

2．2 红曲霉菌株Mr-70菌丝体粉末的制备

2．3 葡萄糖标准曲线的制作

2．4 红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖含量的测定

2．5 红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖提取率的计算

2．6 碱提取红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖的单因素实验

2．7 碱提取红曲霉菌株Mr-70菌丝体多糖的响应面试验设计

3 结果与分析

3．1 葡萄糖标准曲线

3．2 单因素实验结果

3．3 响应面实验结果分析

4 讨论

第六章 红曲霉菌株Mr-70多糖体外抗氧化活性研究

1 材料与仪器

1．1 试验材料

1．2 仪器与药品

2 实验方法

2．1 清除DPPH自由基活性的测定

2．2 清除羟自由基(OH·)活性的测定

2．3 清除超氧阴离子自由基(O2-·)活性的测定

3 结果与分析

3．1 清除DPPH自由基活性

3．2 清除羟自由基(OH·)活性

3．3 清除超氧阴离子自由基(O2-·)活性

4 讨论

第七章 小结与建议

1 小结

2 建议

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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